力竭运动对大鼠肾小管凋亡和缺氧诱导因子-1α表达的影响及人参总皂苷干预研究

王会玲，李燕，田军，胡伟锋，张金元

高强度军事训练或过度运动可能导致急性肾损伤(exercise-induced acute kidney injury，EIAKI)[1]。EIAKI指因剧烈运动或体能训练后，短时间内引起的非创伤性血尿、蛋白尿或肾功能异常[2]。军队新兵入伍训练、大学入学新生体能训练或运动员马拉松长跑等，均容易出现EIAKI。EIAKI是军事医学、运动医学和临床医学面临的亟待解决的问题之一。EIAKI发生机制尚待阐明，目前认为主要与短时间剧烈运动使机体血流动力学发生改变，肾血流灌注相对不足，同时肾组织局部神经内分泌发生急剧变化，从而造成急性肾小管坏死有关[3]。我们既往研究发现，过度运动可引起大鼠急性肾小管损伤，使肾脏局部血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)升高及氧自由基生成增多，氧化应激反应在肾小管损伤中发挥重要作用；人参总皂苷具有一定的抗氧化应激、改善肾损害的作用[4]。近年来研究发现缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)对肾缺血损伤具有重要作用。HIF-1α在EIAKI病理生理过程中发挥何种作用，人参总皂苷是否通过HIF-1α影响肾小管损伤修复，值得进一步研究。因此，本研究探讨人参总皂苷对力竭运动大鼠肾脏肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells，TEC)凋亡以及肾组织HIF-1α表达的影响，以期为人参总皂苷防治EIAKI提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 雄性SD大鼠35只，体重350±10g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：SCXF(沪)2010-0005]，SPF级。人参总皂甙(南京替斯艾么中药研究所)。考马斯亮蓝(美国Bio-Rad公司)；细胞凋亡试剂盒(美国Chemicon ApopTag S7100)；抗体Cleaved-Caspases-3(美国Santa Cruz公司)，HIF-1α(美国Cell signaling公司)，荧光二抗(Alexa Fluor 680/800，Invitrogen公司)，Cell Lytic MT组织裂解液(Sigma公司)，Odyssey远红外激光扫描仪(LiCor公司)。

1.2 实验动物分组 35只大鼠在本实验室适应性饲养2d后，随机分为5组：安静对照组(CTL，n=7)、模型组[再分为2h组(M2，n=7)及24h组(M24，n=7)]、人参总皂苷干预组[再分为2h组(G2，n=7)及24h组(G24，n=7)]。G2和G24组于运动前5d给予人参总皂苷100mg/(kg·d)灌胃，1次/d；M2、M24和CTL组给予等体积蒸馏水灌胃，共5d。

1.3 造模方法及标本收集 跑台运动：大鼠首先以10～15m/min速度进行适应性跑台运动15min，跑台坡度0°；然后使其在30°坡度以25m/min速度持续运动45min或力竭。力竭标准：大鼠不能坚持本负荷跑速，先后滞留跑道3次以上，行为表现为俯卧位、垂头、呼吸幅度大，对刺激无反应。力竭游泳方法：动物休息10min后，置于水深55cm、水温30±2℃的泳池中进行力竭游泳，以大鼠3次沉没于水中超过10s，且放在平面上无法完成翻正反射为力竭，然后将大鼠用电吹风机吹干入笼。CTL组动物在相同条件下常规饲养，不参与跑台及游泳运动。记录各组力竭运动后滞留跑道动物数目以及力竭游泳时间。运动后2、24h后分别处死7只大鼠并采集标本：10%水合氯醛麻醉，断头采血，打开腹腔，暴露肾脏，经0.9%氯化钠溶液灌注，留取双肾，左肾切片2mm厚，置于10%甲醛固定，右肾置于–80℃保存待测。

1.4 肾组织病理学观察 肾组织经脱水、石蜡包埋，切片3μm，常规HE染色，光镜下观察并摄片。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡 肾脏组织标本石蜡包埋，切片厚4μm，常规脱蜡至水，2%过氧化氢于室温反应5min，加入过氧化物酶(TdT酶)缓冲液，室温1～5min，加TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1h，加脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]30min，洗涤，DAB显色，甲基绿复染，二甲苯脱水、干燥、封固。光镜下观察细胞核显示为棕黄色颗粒为阳性凋亡细胞。每张切片随机选取10个以上肾皮髓质交界处高倍视野，计数阳性细胞核数目，并取平均数进行分析。

1.6 免疫组化检测Caspases-3、HIF-1α的表达 石蜡切片4μm厚，常规脱蜡至水，采用ABC法操作常规进行，以PBS代替一抗为阴性对照，阳性呈深棕色。一抗工作浓度：Caspase-3为1:50，HIF-1α为1:100。采用朗珈软件分析系统，高倍下测量免疫组化阳性区域面积(Area)和光密度(A)值，计算免疫组化指数(IHCP=Area×A)。

1.7 Western blotting检测Caspases-3、HIF-1α的表达 提取总蛋白，考马斯亮蓝检测蛋白浓度，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，加入Caspases-3、HIF-1α一抗，4℃过夜；洗膜，加入荧光二抗，孵育30min；洗膜后，Odyssey激光成像扫描。Caspases-3、HIF-1α的蛋白表达量用内参照GAPDH进行校正。

1.8 统计学处理 采用SPSS 14.0软件进行分析，计量数据以s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况及力竭游泳时间 大鼠运动前精神饱满、目光有神、对刺激反应灵敏；运动早中期，大鼠可跟上跑台运动速度和坡度的变化，运动后期因疲劳而滞留跑道；力竭游泳后，大鼠全身瘫软、目光黯淡无神、对周围刺激反应淡漠。与CTL组比较，模型组(n=14)大鼠跑台运动时，11只出现力竭滞留跑道，力竭游泳时间明显缩短(11.32±3.63min)；与模型组比较，人参总皂苷组(n=14)大鼠耐力明显增强，仅6只出现力竭，力竭游泳时间显著延长(19.59±8.26min)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 TEC细胞凋亡 石蜡切片上凋亡细胞核质呈棕黄色荧光染色阳性，或染色不均呈半月形，或形成凋亡小体，浓缩的核质紧贴于核膜。CTL组肾组织仅见少许阳性细胞。模型组在过度运动后2h凋亡数目即增加，M2组可见较多阳性细胞，主要分布于皮髓质交界处的TEC，髓质肾小管和集合管也可见阳性着色；M24组的阳性细胞数目明显增加。G2、G24组的凋亡阳性细胞数目较M2、M24组明显减少(图1)。

图1 TUNEL法检测大鼠TEC细胞凋亡(×40)Fig.1 Apoptosis of tubular epithelial cells detected by TUNEL(×40)

2.3 Caspases-3及HIF-1α在肾组织的分布及表达免疫组化检测显示，Caspases-3阳性呈棕黄色颗粒散在分布于细胞质内，在损伤坏死较明显的部位，可呈深棕色浓染。Caspases-3阳性表达以皮髓质交界处TEC最为明显，髓质的肾小管和集合管可见散在分布，与凋亡细胞分布一致，肾小球几乎无表达。CTL组仅见个别肾小管弱阳性淡染；模型M2组的表达较CTL组增强，M24组的表达明显升高，在刷状缘脱落的肾小管处呈颗粒样强阳性着色。与模型组比较，人参总皂苷干预后G2、G24组的Caspases-3阳性表达均较M2、M24组明显下降。HIF-1α阳性也主要表达于皮髓质交界处TEC，CTL组肾组织几乎未见HIF-1α阳性表达，模型M2、M24组的表达较CTL组明显增强，在损伤肾小管周围的微小血管可呈强阳性表达。与模型组比较，人参总皂苷干预G2、G24组的HIF-1α阳性表达水平较M2、M24组更显著，在损伤小管阳性表达明显，少许肾小球也有表达，G24组的表达也维持在较高水平(图2)。

2.4 肾组织Caspases-3、HIF-1α蛋白的表达水平Western blotting检测结果显示，CTL组仅有微量Caspases-3和HIF-1α蛋白表达，模型组Caspases-3显著上调，M2组上调约2.7倍、M24组上调约3.0倍；而人参皂苷干预组的Caspases-3表达水平较CTL组明显升高，但与模型组比较则呈一定程度下调，G2、G24组分别较M2、M24组下调约58%、61%(图3A)。M2组HIF-1α表达水平上调约2.8倍，M24组上调约2.2倍(P＜0.01)；人参总皂苷G2组的HIF-1α表达与CTL组比较上调4.6倍，与M2组比较上调约1.6倍；G24组的HIF-1α表达较CTL组上调3.7倍，较M24组上调约1.5倍，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01，图3B)。

图2 免疫组化检测大鼠肾组织Caspases-3及HIF-1α表达(×40)Fig.2 The expression of caspases-3 and HIF-1α in rat' kidney detected by immunohistochemistry(×40)

图3 肾组织Caspases-3(A)及HIF-1α(B)蛋白表达水平(Western blotting)Fig.3 Protein expression of caspases-3 (A) and HIF-1α (B) in rat' kidney detected by Western blotting

3 讨 论

运动与肾脏损伤的关系尚待明确。一般认为低强度耐力训练对机体的应激性刺激较小，而高强度过度运动可损伤机体，产生疲劳甚至过度疲劳，成为不良刺激因素而产生损害。研究发现运动可引起健康人群尿蛋白排泄明显增加，马拉松运动后1h尿白蛋白排泄率从15μg/min上升至316μg/min；肾血流量可下降31%，肾小球滤过率也有轻微降低，尿中肾损害标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)升高7.7倍[5]。轻中度运动量引起肾小球性蛋白尿(尿白蛋白)增加，而高强度运动可使肾小管性蛋白尿(β2微球蛋白)排泄增加[6]。EIAKI的肾损伤机制不明，目前认为氧化应激损伤可能是过度运动致肾损伤的主要机制。短时间高强度超负荷的运动，影响机体血流动力学，使肾脏组织供血急剧减少，形成运动性肾缺血，而运动后随着肾脏血供恢复，可形成缺血性再灌注，导致肾脏局部氧化应激反应加剧，氧自由基活性增强，从而造成对肾细胞的实质性损害，主要表现为皮髓交界部的肾小管发生细胞凋亡[7]。

细胞凋亡是早期肾损伤细胞死亡的主要形式，在多种肾病模型中均观察到肾组织细胞凋亡现象，Caspase-3作为关键执行分子，是细胞凋亡性死亡的最终执行者[8-9]。文献报道高强度运动可使肾脏局部脂质过氧化反应增强，对细胞生物膜产生毒害作用，同时引起皮髓质血管紧张素Ⅱ水平升高，诱导肾组织凋亡[8,10]；大鼠游泳至力竭可导致明显的肾组织细胞凋亡，力竭后24h在肾组织皮髓质交界处及髓质肾小管和集合管，可见大量散在成片状分布的凋亡细胞，并可能通过破坏TEC的Bax/Bcl-2信号平衡，激活Caspases-3依赖的凋亡信号通路，进而诱导TEC凋亡[11-12]。

人参总皂苷是中药人参的提取物，具有提高机体免疫力、抗衰老、减轻组织器官的缺血再灌注损伤，减轻细胞内钙超负荷、抗细胞凋亡等作用[13]。研究提示，人参总皂苷可减轻细胞线粒体的损伤、改善缺氧组织的能量代谢，保护缺血损害时细胞膜及其亚细胞结构，对缺血性肾衰竭肾脏具有明显的保护作用[14-15]。我们通过跑台运动及力竭游泳方法制作大鼠EIAKI模型，应用TUNEL法检测肾固有细胞凋亡情况，发现模型组在过度运动后2h皮髓质交界处TEC凋亡数目即增加，24h后凋亡细胞明显增加；而人参总皂苷干预治疗后，上述阳性细胞数目明显下降，证明人参总皂苷可改善细胞EIAKI引起的TEC凋亡，结果提示过度运动加力竭游泳可引起肾小管上皮损伤，导致细胞凋亡，人参总皂苷可改善细胞凋亡。对肾组织免疫组化分析显示，过度运动后造成肾小管局部损伤，凋亡关键信号蛋白Caspases-3表达增强，24h时在刷状缘脱落的小管处呈颗粒样强阳性着色；而人参总皂苷干预G2、G24组的Caspases-3阳性表达均较M2、M24组明显下降。Western blotting检测结果也显示，模型组Caspases-3蛋白表达水平在2、24h逐渐上调，提示人参总皂苷可通过下调Caspases-3依赖的凋亡信号，抑制TEC凋亡，从而保护过度运动后的肾损伤。

HIF-1α是介导缺氧适应性反应的细胞转录因子，广泛参与氧敏感特异性调控应答，在低氧时迅速启动基因激活，并通过核移位和转录活化、蛋白表达的调节等发挥作用，使机体对缺血缺氧产生适应性反应，是缺氧诱导基因调控和修复细胞内氧环境稳定的核心调节因子[16-17]。HIF-1α高表达于TEC，其对急性肾损伤的保护作用近年来受到重视。Rosenberger等[18]对大鼠AKI模型的研究发现，HIF-1α早期快速激活对肾脏在缺氧损伤中的反应性保护具有重要作用。本研究发现HIF-1α表达水平在模型组M2上调约2.8倍，在M24上调约2.2倍，这可能是机体对缺血缺氧的一种保护性反应。人参总皂苷干预组HIF-1α在早期即快速上调，并持续高水平表达，提示人参总皂苷通过上调HIF-1α表达水平，减轻了肾组织的缺血缺氧损害，这可能是人参总皂苷改善肾损伤的重要机制之一，其影响环节有待进一步研究。

综上所述，过度运动可导致大鼠TEC凋亡，Caspases-3表达水平上调；人参总皂苷可通过下调Caspases-3依赖的凋亡信号，快速上调HIF-1α表达水平，减轻TEC凋亡，从而保护过度运动后的肾损伤，这可能是人参总皂苷改善过度运动性肾损伤的重要机制之一。

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