温9302地黄块根中化学成分动态积累规律研究△

陈燕，姜迪，张飞，陈随清

(河南中医学院，河南 郑州 450046)

十二五国家科技支撑计划(2011BAI06B02)；名贵中药资源可持续利用能力建设—地黄全国生产区划研究(20603020222)

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陈随清，教授，研究方向：中药品种整理与质量标准研究；Tel：(0371)65676686，E-mail：suiqingchen@sohu.com

温9302地黄块根中化学成分动态积累规律研究△

陈燕，姜迪，张飞，陈随清*

(河南中医学院，河南 郑州 450046)

目的研究地黄块根在生长过程中主要化学成分的动态积累规律。方法采用HPLC法、RP-HPLC-RID法、硫酸-苯酚法分别对地黄中梓醇和毛蕊花糖苷、单寡糖、多糖进行含量测定；采用氨基酸自动分析仪测定地黄中氨基酸含量；采用SPSS软件对各成分进行主成分分析。结果地黄块根中梓醇含量呈上升趋势；毛蕊花糖苷、葡萄糖、棉籽糖含量呈逐渐降低趋势；多糖、蔗糖、水苏糖、氨基酸含量呈曲线变化；水浸物含量总体变化不大。结论地黄块根中各化学成分含量均在11月初达到较高值，此时期最宜采收，与传统地黄采收期相吻合。

地黄；化学成分；动态积累；主成分分析

地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch的块根。在我国有悠久的药用历史。近年来对地黄的研究主要集中在其化学成分[1-3]、药理作用、组织结构[4]等方面。我们对地黄药材的化学成分动态积累规律进行了研究，温9302地黄品种为近几年河南怀地黄产区发展的主流品种，对其基础研究较少，有关其生长过程中主要化学成分动态积累规律的研究甚少。本研究测定了温9302地黄块根在一个生长周期内不同化学成分含量的变化，同时对各成分进行主成分分析，为地黄药材的质量评价及适宜采收期的确定提供科学依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

温9302地黄样品采自河南省温县，经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch的块根。用于含量测定的样品为新鲜地黄块根，切片，60°烘干；用于显微观测的样品为新鲜地黄块根，切0.5～0.6cm小段，用F.A.A固定液(70%乙醇∶冰醋酸∶40%甲醛=90∶5∶5)固定。

1.2 仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪(2998紫外检测器，2414示差折光检测器)；岛津UV-2600紫外可见分光光度计；对照品梓醇(中国食品药品检定研究所，批号110808-201009，含量测定用)、毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究所，批号111530-200706，含量测定用)、葡萄糖(中国食品药品检定研究所，批号110833-200503，含量测定用)、蔗糖(中国食品药品检定研究所，批号111507-200302，含量测定用)、水苏糖、(天津一方科技有限公司，批号BBT0176，含量测定用)、棉籽糖(天津一方科技有限公司，批号BBT0177，含量测定用)；甲醇、乙醇均为色谱醇(Fisher Scientific，4L)，双蒸水。

2 方法和结果

2.1 地黄化学成分的测定

2.1.1 梓醇、毛蕊花糖苷、水溶性浸出物的含量测定 根据2010年版《中国药典》相关项进行。对梓醇、毛蕊花糖苷含量测定进行了方法学考察，包括稳定性、重现性、精密度以及加样回收率等试验，结果均符合含量测定要求，测定结果见表1，两种成分的对照品HPLC图谱见图1、图3，样品图谱见图2、图4。

图1 梓醇标准品HPLC色谱图

图2 梓醇样品HPLC色谱图

图3 毛蕊花糖苷对照品HPLC色谱图

图4 毛蕊花糖苷样品HPLC色谱图

2.1.2 多糖的含量测定 取地黄粉末0.1 g置于具塞锥形瓶中，加95%乙醇溶液50 mL，震荡2 h，取出过滤，再加80%乙醇溶液50 mL，震荡2小时，取出过滤，滤渣晾干，加50 mL蒸馏水，放置水浴锅中温浸3 h。取出过滤，取续滤液3 mL置10 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度即得供试品溶液。取制备好的供试品溶液2 mL，置10 mL的具塞试管中，加5%的苯酚溶液1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，静置5分钟，水浴加热15 min，取出冷却至室温，紫外可见分光光度法测定其吸光度。对试验的稳定性、重现性、精密度以及加样回收率进行了研究，结果均符合含量测定要求。含量测定结果见表1。

2.1.3 单、寡糖的含量测定 采用高效液相色谱法同时对葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖进行含量测定。对试验的稳定性、重现性、精密度以及加样回收率进行了研究，结果均符合含量测定要求。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶水=70∶30；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL。对照品及样品HPLC色谱图见图5、图6。

精密称定样品粉末1.5 g，置具塞锥形瓶中，加水50 mL，称定重量，100℃水浴2 h，放冷，再称定重量，用双蒸水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，用等量石油醚、乙酸乙酯依次萃取两次，0.22 μm微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定含量。含量测定结果见表1。

A.葡萄糖 B.蔗糖 C.棉籽糖 D.水苏糖图5 混合标准品

图6 地黄样品单、寡糖色谱图

2.1.4 氨基酸的含量测定 采用氨基酸自动分析仪按GB/T5009.124-2003测定。

精密称取地黄药材粉末0.1 g，置水解管内，加6 mol·L-1盐酸10 mL。加新蒸馏苯酚3滴，再将水解管放入冰中，冷冻5 min，抽真空(接近0 Pa)后充入氮气，重复3次。将水解管放入恒温干燥箱，110 ℃水解22 h，取出冷却至室温滤过，取续滤液1 mL于5 mL容量瓶内，双蒸水定容。在真空干燥箱50 ℃干燥，残留物用双蒸水水解，再干燥，反复进行两次，用1 mL PH 2.2缓冲液溶解，供仪器测定用。将混合氨基酸标准品用pH 2.2缓冲液配成浓度为0.1 nmol·μL-1，用氨基酸自动分析仪测定。测定结果见表1。

表1 不同时期地黄块根中化学成分含量测定结果

3 结果分析

3.1 不同时期地黄块根多个化学成分含量比较

由表1中各成分含量测定结果可以看出，在一年的生长过程中，地黄块根中梓醇含量呈上升趋势，并在10月至11月基本稳定在一个较高水平；地黄中毛蕊花糖苷的含量呈下降趋势，在地黄生长初期含量较高，至10月中旬含量开始降低，在11月维持在较低水平；地黄中除总多糖外，单糖葡萄糖、寡糖中的蔗糖、棉籽糖、水苏糖含量也比较高。测定结果表明，地黄块根中多糖含量在一个生长周期内呈折线变化，在10月中旬地上部分开始枯萎时，含量逐渐升高，至11月初达到较高值，然后下降至一个较低水平；葡萄糖含量呈逐渐降低趋势，在地黄生长初期含量较高，进入10月后含量开始降低，至10月中旬降至最低，并稳定在一个较低水平；寡糖中蔗糖的含量也呈折线变化，在11月初达到最大值；寡糖中棉籽糖的含量较低，在5%以下，含量呈逐渐降低趋势；寡糖中水苏糖的含量最大，进入10月后地黄块根中水苏糖的含量有一个先升高再降低的变化，但含量变化不大；总氨基酸含量呈折线变化，在10月中旬地上部分开始枯萎后，维持在一个较高水平。另外，地黄块根中水溶性浸出物的含量总体变化不大，含量基本维持在一个水平。

3.2 不同时期主成分分析

主成分分析是多元统计中的一种资料挖掘技术。它在不丢失主要变量信息的前提下选择为数较少的新变量来代替原来较多的变量，以排除众多化学信息共存中相互重迭的信息。为更加准确的对地黄质量作出评价，本研究利用主成分分析，将9个单一成分指标综合成为3个综合指标，根据3个综合指标的贡献率求出其相应隶属函数值，并根据各综合指标的相对重要性进行加权，得到一个生长周期内地黄质量的综合评价值，结果见表2。综合评价结果表明：地黄在第6时期综合评价排名最高，即在11月初，地黄质量评价最好，最宜采收。

表2 地黄块根中9个成分累积贡献率

由上表可知，当地黄85-5主成分个数为3时，累计贡献率已经有了85.5%，所以主成分个数取3个即可，则其对应的特征向量为：

Y1=-0.362X1+0.003X2-0.404X3+0.245X4+0.256X5+0.345X6+0.373X7-0.428X8-0.372X9

Y2=0.367X1-0.439X2-0.327X3+0.407X4-0.291X5+0.376X6-0.352X7-0.116X8+0.192X9

Y3=0.254X1+0.476X2+0.06X3+0.117X4+0.56X5+0.189X6-0.149X7-0.275X8+0.495X9

即：W=0.532482Y1+0.315386Y2+0.152132Y3

由表1中的数据，可计算出Y1，Y2，Y3，同时可计算出W，从而得出综合评价结果，排名见表3。

表3 地黄块根7个时期的综合评价结果及排名

4 讨论

地黄块根不同生长时期，化学成分含量明显不同。地黄生长初期梓醇含量较低，至10月中旬地上部分开始枯萎后，梓醇含量迅速增高，并在11月保持较高水平。李建军等[5]研究发现，地黄总糖在块根中的分布比较广，有可能集中于韧皮部和木质部的输导组织中。王太霞等[6]研究发现怀地黄块根有效成分的含量高峰与其产量高峰一致，均在11月初时；本研究结果表明地黄块根在11月初期，各成分含量均达到较高水平，与传统采收期相符合。综上所述，中药采收期不仅决定中药材的外观形态，而且直接影响中药材的化学成分和药效，适宜的采收期是确保中药材质量稳定可靠的前提和基础。本研究表明地黄传统采收期具有一定的科学性及可行性。

[1] 邱建国，张汝学，贾正平，等.HPLC测定不同产地生地黄中地黄寡糖和梓醇的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(17)：110-113.

[2] 李晓琳，王敏，刘红彦.地道产区地黄不同品种间多糖量的比较[J].中草药，2008，39(8)：1251-1253.

[3] 李建军，王莹，陈小洁，等.不同产区地黄产量及指标成分的HPLC测定[J].河南农业大学学报，2011，45(4)：387-390.

[4] 刘孟奇，王小巧，陈随清，等.地黄的组织化学研究[J].中药材，2013，36(11)：1771-1773

[5] 李建军，孙华，王太霞，等.怀地黄不同品种块根显微结构与糖分含量的比较研究[J].河南大学学报，2007，37(5)：505-508.

[6] 王太霞，李景原，胡正海.怀地黄营养器官中梓醇的积累动态[J].中草药，2004，35(2)：208-209.

CorrelativeAnalysisBetweenChangeRegularityofChemicalCompositionandOrganizationalStructureinRehmanniaglutinosaLibosch

CHENYan，JIANGDi，ZHANGFei，CHENSuiqing

(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046，China)

Objective：To study the changes of chemical composition in the roots ofRehmanniaglutinosaduring its growth process.MethodsDetermined the content of catalpol verbascoside，single oligosaccharides and polysaccharides in the roots ofR.glutinosaby HPLC，RP-HPLC-RID and sulfuric acid-phenol method.Use automatic amino acid analyzer to determine the content of amino acid in the roots ofR.glutinosa.Use SPSS to do Principal component analysis.ResultsIn the roots ofR.glutinosa，the content of catalpol is on upward trend；the content of verbascoside，glucose and raffinose is on a downward trend；the content of polysaccharide，sucrose，stachyose and amino acid is a line change；the content of water-soluble extractives is a little change.ConclusionThe content of chemical composition in the roots ofR.glutinosawas higher in early November，it is the good time to harvest，it was coincided with the traditional harvest of the roots ofR.glutinosa.

Rehmanniaglutinosa；Chemical composition；Dynamic accumulation；The principal components analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.012

2013-12-02)