复方山楂颗粒的质量标准研究

马宏达，何 进，胡 北，王琳琳，史国兵（沈阳军区总医院药剂科，沈阳 110016）

复方山楂颗粒为沈阳军区总医院院内制剂，是由山楂和决明子组成的复方中药制剂，具有散瘀消食的功效，临床上用于治疗高脂血症。复方山楂颗粒中山楂为君药，山楂为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥果实，具有消食健脾、行气散瘀、化浊降脂［1］的功效，临床上主要用于治疗肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛，现代药理学研究表明，山楂果实、山楂叶具有助消化、降压、降脂等作用［2］。齐墩果酸和熊果酸是已确知的山楂三萜酸类代表性化学成分，二者结构相近且含量差别较大，故需进行分离测定以便更好地控制山楂制剂的质量。因此，本文采用高效液相色谱法对山楂中的齐墩果酸和熊果酸进行含量测定，并采用薄层色谱法对方中山楂进行定性鉴别，建立了该制剂的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（配备501型泵，486型紫外检测器，美国Waters公司）；AUW 120D型电子分析天平（岛津公司）；水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 复方山楂颗粒（批号20130506，2013612，20130722）及各阴性样品均由沈阳军区总医院自制；齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为：110709－200505）；熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110742－200519）；水为重蒸水（自制）；甲醇（色谱纯，天津四友生物技术有限公司）；乙腈（色谱纯，购自Fisher公司）；乙酸铵（国药集团化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 山楂的薄层鉴别 取本品5g，加入甲醇50mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使其溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液。另取山楂对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例制成的缺山楂的阴性样品5g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－环己烷－甲酸（10∶6∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇－乙腈－10mmol·L－1乙酸铵（55∶27∶18）［3］；流速：1.0mL·min－1；检测波长：215nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 取置于五氧化二磷干燥器中减压干燥12h以上的齐墩果酸和熊果酸对照品，精密称定，加入适量甲醇使溶解，制成每1mL含40μg的熊果酸及10μg的齐墩果酸的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品研细，称取约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，密塞，超声处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得［4－5］。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取按处方除去山楂的阴性样品0.5g，按2.2.3项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.2.5 专属性考察 分别精密吸取阴性对照溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定结果见图1。

结果表明，齐墩果酸、熊果酸的保留时间分别约为37和39min，阴性对照样品不干扰齐墩果酸、熊果酸的测定，齐墩果酸、熊果酸与其他成分或杂质的分离度大于1.5，理论板数按熊果酸峰计算应均不低于3 000。

2.2.6 线性关系考察 精密吸取质量浓度为2.5，5，10，20，40和80μg·mL－1的齐墩果酸和质量浓度为10，20，40，80，160和320μg·mL－1的熊果酸混合对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按2.2.1色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品质量浓度（μg·mL－1）为横坐标、峰面积值为纵坐标，求得齐墩果酸的回归方程：y＝5 039.5x＋2 262.9，r＝0.999 6，结果表明，齐墩果酸的质量浓度在2.5～80μg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系；熊果酸的回归方程y＝5 250.6x－9 724.7，r＝0.999 7，结果表明，熊果酸的质量浓度在10～320μg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图A.齐墩果酸对照品和熊果酸对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.齐墩果酸；2.熊果酸Fig.1 HPLC chromatogramsA.oleanic acid reference and ursonic reference；B.test sample；C.negative control；1.oleanic acid；2.ursonic

2.2.7 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液20μL，按2.2.1色谱条件分析，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，测得齐墩果酸峰面积值的RSD＝1.15%（n＝6），熊果酸峰面积值的RSD＝1.02%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液，按2.2.1色谱条件分析，分别在0，2，4，6，8和10h测定各自样品中齐墩果酸和熊果酸的峰面积，测得齐墩果酸峰面积值的RSD＝1.85%（n＝6），熊果酸峰面积值的RSD＝1.65%（n＝6），表明供试品溶液在10h内稳定。

2.2.9 重复性实验 取同一批样品，研细，取约0.5g（共6份），精密称定，按照2.2.3供试品溶液制备操作，按2.2.1色谱条件分析，测定每份样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。结果样品中齐墩果酸平均含量为1.036 9mg·g－1，RSD＝2.27%（n＝6），熊果酸平均含量为4.081 1mg·g－1，RSD＝1.78%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率实验 取同一批样品，研细，取约0.25g（共6份），精密称定，分别加入齐墩果酸对照品溶液（0.9mg·mL－1）各1mL，熊果酸对照品溶液（0.25mg·mL－1）各1mL，称定质量，再按照2.2.3供试品溶液制备操作，制成回收率用供试品溶液，按2.2.1色谱条件分析，测定样品中含量，计算回收率，结果齐墩果酸平均回收率为98.4%，RSD＝2.1%（n＝6），熊果酸平均回收率为98.6%，RSD＝1.9%（n＝6），结果见表1。

表1 加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 样品含量测定 取3批样品各约0.5g，分别按照2.2.3供试品溶液制备操作，按2.2.1色谱条件进样测定峰面积，以外标法计算3批样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。结果3批样品中齐墩果酸的含量分别为1.000 2，1.079 1和1.046 6mg·g－1；3批样品中熊果酸的含量分别为3.889 4，4.113 7和4.024 8mg·g－1。

3 讨论

本实验考察了不同流动相对分离度的影响，如：甲醇－5mL·L－1磷酸水溶液（88∶12），甲醇－5mL·L－1磷酸水溶液（86∶14），甲醇－5mL·L－1醋酸水溶液（82∶18），乙腈－5mL·L－1磷酸水溶液（85∶15），甲醇－乙腈－10mmol·L－1醋酸铵（55∶27∶18），最终确定了最佳流动相为甲醇－乙腈－10mmol·L－1醋酸铵（55∶27∶18），分离度＞1.5，分离效果较好。

由于熊果酸和齐墩果酸均属三萜酸，且结构极为相似，两者极性几乎无差别，因此在薄层板上很难将2种成分分离开，而这2种成分在天然植物中似乎又是共生共存的，因此，建立HPLC法对其进行含量测定就显得尤为重要。本实验采用HPLC法测定复方山楂颗粒中齐墩果酸和熊果酸的含量，方法简便、可靠、准确，可用于复方山楂颗粒中齐墩果酸和熊果酸的质量控制。

［1］国家药典委员会.中国药典2010年版 ［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：29.

［2］王嫦鹤，张秉华，刘芳，等.HPLC法同时测定山楂中的山楂酸、齐墩果酸和熊果酸［J］.西北药学杂志，2011，26（1）：35－37.

［3］石静，聂晶，冯钰锜，等.HPLC法测定女贞叶乙醇提取物中的齐墩果酸与熊果酸［J］.现代药物与临床，2010，25（3）：210－214.

［4］白雪梅，付煜荣，田嘉铭.高效液相色谱法测定大山楂丸和山楂鲜果中齐墩果酸及熊果酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26（8）：981－982.

［5］崔洪泉，蒋秀芳.高效液相色谱法测定山楂药材中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.临床合理用药，2011，4（7）：109－110.