血竭超微细粉和普通细粉在六白白疕巴布剂中体外透皮释药研究

董希光　王超　张伟　于爽　孙晶

[摘要] 目的 对比研究血竭超微细粉和普通细粉在六白白疕巴布剂中主要药效成分血竭素的体外透皮释药情况，为该巴布剂制备工艺研究提供参考依据。 方法 使用药物透皮扩散实验仪，以色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液（0.05 mol/L）（50∶50）、检测波长440 nm、柱温40℃、流速1 mL/min的高效液相色谱法（HPLC）色谱条件，检测两种巴布剂样品中血竭素12 h内透过离体兔皮释药情况。 结果 HPLC检测方法显示血竭素峰分离效果良好，稳定性、精密度和加样回收试验的RSD分别为1.14%、0.92%、0.89%，符合含量测定要求；两种样品巴布剂1～2 h内均为快速透皮释药阶段，2～12 h为平稳缓慢透皮释药阶段。其中超细粉样品巴布剂2、4、12 h内血竭素累积透皮释药率分别为29.12%、38.60%和59.36%，而普通细粉样品巴布剂在同一时间段仅为16.74%、21.77%和44.28%。在考察的12 h内，超微细粉样品巴布剂血竭素累积透皮释药率高于普通细粉样品巴布剂15%左右。 结论 本含量测定方法良好，以血竭药物超微细粉作为该巴布剂的填充剂，血竭素体外透皮释药效果明显优于以普通细粉作为巴布剂填充剂的样品巴布剂。

[关键词] 超微细粉；普通细粉；血竭素；高效液相色谱法；含量测定；透皮释药

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（b）-0004-05

六白白疕巴布剂是以山东省青岛市海慈医疗集团制剂实验室（以下简称“我室”）中药制剂六白膏进行剂型改革，研制而成的一种新型外用中药巴布制剂。前期曾就组方药物提取和主要药效成分甘草酸体外离体兔皮透皮释药进行实验研究[1-2]。本实验对六白白疕巴布剂组方药物的另一种主要药物血竭制成超微细粉和普通细粉两种粉体样品巴布剂中血竭素不同时段的离体兔皮体外透皮释药情况进行对比研究，为该巴布剂制备工艺提供试验参数。现报道如下：

1 仪器与材料

RYJ-6B型药物透皮扩散实验仪（上海），安捷伦1100高效液相色谱系统（美国Agilen公司）；DJ-10A电动粉碎机（上海）；WKZ-10型超微粉碎破壁机（潍坊产）；Rise-2002型激光粒度分析仪（济南）。

血竭素高氯酸盐对照品（含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110811-200704，）；乙腈（色谱纯，天津凯信化学试剂公司）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

健康白色家兔，体重（1.85±0.16）kg（市售）；药材取自我室中药房。经青岛市药检所中药科吴爱英主任药师鉴定为麒麟竭Daemonorops draco Bl.树脂加工品。巴布剂样品由我室制备。

2 方法与结果

2.1 样品巴布剂制备

按不含血竭的处方比例取白鲜皮、甘草等药材饮片225 g，用50%乙醇制成醇提水沉液200 mL，分别用提取液100、40、60 mL，将阿拉伯胶30 g、聚乙烯醇10 g、西黄耆胶20 g进行浸泡，水浴加热使其溶胀，分别制成透明胶状液；另将将甘油20 mL、平均粒径25 μm血竭超微细粉3 g加到乳钵中研匀；再将阿拉伯胶透明胶状液、西黄耆胶透明胶状液、聚乙烯醇透明胶状液依次倒入乳钵中研匀，待稍冷，趁温时均匀涂布于无纺布上，厚度约为0.70 mm，置40℃烘箱下烘0.5 h，盖上防粘层，制成每克含血竭30 mg的超微细粉样品巴布剂。

另取平均粒径为120 μm的普通细粉，按上述相同方法制成每克含血竭30 mg的普通细粉样品巴布剂。

2.2 血竭素含量测定方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液（0.05 mol/L）（50∶50）；检测波长为440 nm；柱温为40℃；流速为1 mL/min；进样量为10 μL。理论板数按血竭素峰计算不低于4000。

2.2.2 对照品储备液制备 精密称取血竭素高氯酸盐对照品0.9615 mg，置于10 mL容量瓶中，加入3%磷酸甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为96.15 μg/mL的对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液制备 揭取样品巴布剂膏体约2 g，剪碎，精密称重，置具塞锥瓶中，加入20 mL氨试液将膏体浸润、溶胀、碱化，三氯甲烷密塞振摇提取2次，每次用量10 mL，每次提取时间3 min。合并三氯甲烷提取液，并用三氯甲烷定容至50.0 mL。取提取液5.0 mL，挥干，残渣用0.3%磷酸甲醇溶液溶解定容至5.0 mL，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照品溶液制备 照处方比例和制备工艺制备不含血竭的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按上述色谱条件进样，记录色谱图，结果表明阴性对照溶液对血竭素测定无干扰。色谱图见图1～3。

2.2.5 线性关系考察 分别精密量取浓度为96.15 μg/mL的对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入3%磷酸甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为1.923、3.846、7.692、11.538、15.384、19.230 μg/mL的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=2.2651×104X+2.8973×103（r=0.9974）。结果表明，血竭素进样浓度在1.923～19.23 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：090612），分别在0、1、2、4、6 h分别精密吸取10 μL，依法测定峰面积积分值RSD为1.14%，表明供试品溶液在室温下放置6 h内稳定。

2.2.7 精密度试验 精密吸取浓度为7.692 μg/mL的对照品溶液10 μL，依法连续测定5次，峰面积积值RSD为0.92%。说明仪器精密度较好。

2.2.8 加样回收率试验 取5份已知含量浓度为9.22 μg/mL的同一批样品巴布剂溶液（批号：090612）0.5 mL，加到1.0 mL的容量瓶中，分别精密加入7.692 μg/mL对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL，0.3%磷酸甲醇溶液定容，混匀后按“2.1”项下色谱条件依法测定、计算回收率。平均加样回收率分别为97.846%，RSD为0.89%（n=5）。加样回收率试验表明，所建方法加样回收率高，符合含量测定的要求。结果见表1。

结果表明，在选定的色谱条件下，采用适量氨试液浸润、溶胀巴布剂膏体，并碱化解离组方药物中的血竭素甘草酸，再用三氯甲烷提取血竭素，目标成分分离度高，稳定性好，仪器精密度和加样回收率高，其他成分无干扰，含量测定准确性，可以作为六白白疕巴布剂血竭素含量测定方法。

2.3 血竭素提取方法考察

2.3.1正交优化实验 由于六白白疕巴布剂组方药物中的甘草所含甘草酸，易与血竭素形成盐，影响血竭素在三氯甲烷提取液中转溶。实验用适量氨试液浸润溶解巴布膏膏体，同时碱化、游离血竭素的甘草酸盐，以提高血竭素在三氯甲烷等溶剂中的提取转移率。在单因素考察的基础上，用20 mL氨试液将约2 g巴布剂膏体浸润并解离血竭素甘草酸盐，对三氯甲烷的提取次数（A）、溶剂用量（B）和提取时间（C）三个因素及三个因素的交互作用进行L8（27）试验方案设计。试验方案及实验结果见表2，方差分析见表3。

2.3.2 影响因素正交分析 直观分析表明，因素影响大小顺序为B>C>A，最佳工艺为A2B2C2；方差分析显示提取次数（A）、溶剂用量（B）和提取时间（C）三个因素对实验结果有统计学意义（P<0.05或P<0.01），而三个因素间的交互作用对试验结果差异无统计学意义。对最佳工艺A2B2C2（即试验8）的残留膏体测定血竭素成分，结果未能检测出血竭素成分，表明此法血竭素基本提取完整，可以作为样品含量测定的提取检测方法，即约2 g膏体量，用20 mL氨试液浸润、溶解、碱化，三氯甲烷密塞振摇提取2次，每次用量15 mL，每次提取时间为3 min。

2.3.3 样品巴布剂含量测定 取超微粉样品巴布剂三批样品，批号分别为20130618、20130622、20130627，按“2.3”项下优化方案及“2.2.3”项下制备方法，即约2 g膏体量，用20 mL氨试液浸润、溶解、碱化，三氯甲烷密塞振摇提取2次，每次用量15 mL，每次提取时间3 min。合并三氯甲烷提取液，并用三氯甲烷定容至50.0 mL。取提取液5.0 mL，挥干，残渣用0.3%磷酸甲醇溶液溶解定容至5.0 mL，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，测定血竭素含量，每批样品重复测定3 次。测定结果见表4。三批样品3次测定的RSD分别为1.34%、0.59%和0.40%，表明重复性好；三批样品三次测定均值的RSD为0.81%。同法测定普通粉样品巴布剂三次样品（批号分别为20130708、20130716、20130724）血竭素平均含量。测定结果见表5。三批样品3次测定的RSD分别为0.52%、0.42%和0.45%，表明重复性好；三批样品均值的RSD为0.36%。

2.4 透皮释药实验

2.4.1 离体兔皮的制备 将健康白色家兔腹部皮毛用脱毛剂脱毛，静养24 h后处死，剥取腹部皮肤，除尽皮下黏膜及脂肪组织，用生理盐水洗净，置生理盐水中低温冷冻保存备用。

2.4.2 兔皮安装 将兔皮固定于样品室与接受室之间， 接受池中加入（37±1）℃保温的生理盐（释药接受液），真皮一侧与接受液充分接触，排净空气；给药室兔皮角质层一侧用吸水滤纸吸干水；开动电磁搅拌器保持恒速搅拌（约200 r/min），维持接受池的动态环境。

2.4.3 释药液制备 取巴布剂样品，剪成直径2 cm左右的圆形小块，揭去防粘层，连带背衬布精密称重，贴敷于兔皮角质层并上夹固定，分别于0.5、1、2、4、8、12、16、24 h共8个时间段从接受池侧口中精密吸取0.05 mL释药液，挥干后用3%磷酸甲醇0.5 mL溶解，移至1 mL容量瓶中，再加入浓度为96.15 μg/mL对照品储备液0.4 mL，加3%磷酸甲醇溶液定容至1.0 mL，混匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，制成释药液。每次取样后立即从接受池侧口补加生理盐水，排净接受池气泡后继续实验。实验结束后将带膏背衬布清水洗净膏体，背衬布干燥称重。折算样品膏体血竭素含量（mg/g）。依法对两种样品的各3个批次进行试验。

2.4.4 累积释药量测定 将释药液按“2.2.1”项下色谱条件测定血竭素含量。每一时段释药液共测3次，取平均值。按不同时段累积释药量（μg）=[实际测定值浓度-外加血竭素浓度（96.15 μg/mL×0.4 mL）]/释药液吸取量（0.05 mL）×接受池容量（mL），累积释药率（%）=累积释药量（μg）/[样品巴布剂净重（g）×每克样品巴布剂血竭素含量（μg/g）]×100%，并与相应样品膏体血竭素含量进行比较，计算不同时段相应样品血竭素释药率。

2.4.5 实验结果 三批次超微粉样品巴布剂（批号：20130618、20130622、20130627）在0.5、1、2、4、8、12、16、24 h释药率3次测定平均值依次为7.24%、18.67%、29.12%、38.60%、49.34%、53.88%、57.17%、59.36%，而三批次普通粉样品巴布剂（批号：20140708、20140716、20140724）在相同时段释药率三次测定平均值依次为1.27%、5.84%、16.73%、21.77%、29.29%、34.82%、38.93%、44.28%。以释药率为纵坐标，时间为横坐标做曲线图，结果见图4。

从累积透皮释药曲线分析，两种样品巴布剂1～2 h内均为快速透皮释药阶段，2～12 h为平稳缓慢透皮释药过程，其中超细粉样品巴布剂2 h和4 h内血竭素累积透皮释药率与普通粉样品巴布剂6 h和10 h内相当，12 h内累积透皮释药率超微细粉样品巴布剂高于普通细粉样品巴布剂15%左右。超微粉样品巴布剂均明显优于普通粉样品巴布剂。

3 讨论

3.1 关于流动相的选择

按照《中国药典》2010年版中血竭素的的含量测定方法进行操作，参考有关文献报道，比较了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（35∶65、40∶60、45∶55、50∶50）多种不同配比[3-8]，结果乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）作为流动相时能够将血竭素与杂质峰完全分离，出峰时间适当，峰形好。

3.2 关于血竭素定容方法

血竭素为色原酮类化合物，性质不稳定，见光易分解，溶液放置颜色会逐渐加深。因此待测样品溶液制备后立即置棕色量瓶中，用3%磷酸甲醇替代《中国药典》2010年版中的甲醇进行定容，使样品中的血竭素形成血竭素的磷酸盐，增强其稳定性[9-10]。稳定性试验考察结果表明，同一供试品溶液在0、1、2、4、6 h时峰面积积分值RSD为1.14%，表明血竭素的磷酸盐在甲醇溶液中6 h内室温下放置是稳定的。

3.3 关于供试品溶液制备

巴布膏剂含量测定难点在于排除基质的干扰，同时最大限度提取转移目标成分。由于六白白疕巴布剂组方药物中的甘草所含甘草酸易与血竭素形成盐，影响血竭素在脂溶性溶剂中的溶解和转移。参考文献报道[11]，对供试品溶液提取检测方法进行考察。结果发现，一定量氨试液既可浸润溶解巴布膏膏体，同时又能碱化、游离血竭素的甘草酸盐，减少其他水溶性成分和基质的影响。提高血竭素在三氯甲烷等溶剂中的提取转移率，实验结果表明，用膏体10倍的氨试液先浸润溶胀巴布膏体，使血竭素甘草酸盐在碱性环境下游离，再用三氯甲烷提取，可以增加血竭素在三氯甲烷相中的溶解转溶，残留膏体未能检测出血竭素成分。表明此法可以基本提取转溶血竭素成分，含量测定精确性高。

3.4 关于超微粉碎

中药材超微粉碎后，可使大部分药材细胞壁膜破裂，有效成分不必经过壁、膜的释放过程，直接暴露在外，有利于提高有效成分的溶出和透皮吸收效果[12-18]；在外用贴膏剂中，由于超微细粉的粒径小，一方面易于从基质材料中渗透出来，另一方面填充在基质中可以减少基质之间的相互作用力，有利于成分释放，提高释药速率[13]。本项研究中，血竭作为组方中的贵重药，在巴布剂剂型研究中替代硅藻土等用作填充剂，可以提高巴布剂药物成分相对比例。本研究结果表明，以血竭素不同时段体外透皮释药量为指标，超微细粉明显优于普通细粉，与有关研究报道等[13-18]研究结论基本一致，为中药以超微粉作为填充剂的外用贴膏剂制剂研究提供了一个新的思路。

[参考文献]

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[18] 俞忠明，戴诗文，寿旦，等.超微粉碎工艺对血竭透皮吸收的影响研究[J].浙江中医杂志，2008，43（6）：359-360.

（收稿日期：2014-05-24 本文编辑：卫 轲）

从累积透皮释药曲线分析，两种样品巴布剂1～2 h内均为快速透皮释药阶段，2～12 h为平稳缓慢透皮释药过程，其中超细粉样品巴布剂2 h和4 h内血竭素累积透皮释药率与普通粉样品巴布剂6 h和10 h内相当，12 h内累积透皮释药率超微细粉样品巴布剂高于普通细粉样品巴布剂15%左右。超微粉样品巴布剂均明显优于普通粉样品巴布剂。

3 讨论

3.1 关于流动相的选择

按照《中国药典》2010年版中血竭素的的含量测定方法进行操作，参考有关文献报道，比较了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（35∶65、40∶60、45∶55、50∶50）多种不同配比[3-8]，结果乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）作为流动相时能够将血竭素与杂质峰完全分离，出峰时间适当，峰形好。

3.2 关于血竭素定容方法

血竭素为色原酮类化合物，性质不稳定，见光易分解，溶液放置颜色会逐渐加深。因此待测样品溶液制备后立即置棕色量瓶中，用3%磷酸甲醇替代《中国药典》2010年版中的甲醇进行定容，使样品中的血竭素形成血竭素的磷酸盐，增强其稳定性[9-10]。稳定性试验考察结果表明，同一供试品溶液在0、1、2、4、6 h时峰面积积分值RSD为1.14%，表明血竭素的磷酸盐在甲醇溶液中6 h内室温下放置是稳定的。

3.3 关于供试品溶液制备

巴布膏剂含量测定难点在于排除基质的干扰，同时最大限度提取转移目标成分。由于六白白疕巴布剂组方药物中的甘草所含甘草酸易与血竭素形成盐，影响血竭素在脂溶性溶剂中的溶解和转移。参考文献报道[11]，对供试品溶液提取检测方法进行考察。结果发现，一定量氨试液既可浸润溶解巴布膏膏体，同时又能碱化、游离血竭素的甘草酸盐，减少其他水溶性成分和基质的影响。提高血竭素在三氯甲烷等溶剂中的提取转移率，实验结果表明，用膏体10倍的氨试液先浸润溶胀巴布膏体，使血竭素甘草酸盐在碱性环境下游离，再用三氯甲烷提取，可以增加血竭素在三氯甲烷相中的溶解转溶，残留膏体未能检测出血竭素成分。表明此法可以基本提取转溶血竭素成分，含量测定精确性高。

3.4 关于超微粉碎

中药材超微粉碎后，可使大部分药材细胞壁膜破裂，有效成分不必经过壁、膜的释放过程，直接暴露在外，有利于提高有效成分的溶出和透皮吸收效果[12-18]；在外用贴膏剂中，由于超微细粉的粒径小，一方面易于从基质材料中渗透出来，另一方面填充在基质中可以减少基质之间的相互作用力，有利于成分释放，提高释药速率[13]。本项研究中，血竭作为组方中的贵重药，在巴布剂剂型研究中替代硅藻土等用作填充剂，可以提高巴布剂药物成分相对比例。本研究结果表明，以血竭素不同时段体外透皮释药量为指标，超微细粉明显优于普通细粉，与有关研究报道等[13-18]研究结论基本一致，为中药以超微粉作为填充剂的外用贴膏剂制剂研究提供了一个新的思路。

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[18] 俞忠明，戴诗文，寿旦，等.超微粉碎工艺对血竭透皮吸收的影响研究[J].浙江中医杂志，2008，43（6）：359-360.

（收稿日期：2014-05-24 本文编辑：卫 轲）

从累积透皮释药曲线分析，两种样品巴布剂1～2 h内均为快速透皮释药阶段，2～12 h为平稳缓慢透皮释药过程，其中超细粉样品巴布剂2 h和4 h内血竭素累积透皮释药率与普通粉样品巴布剂6 h和10 h内相当，12 h内累积透皮释药率超微细粉样品巴布剂高于普通细粉样品巴布剂15%左右。超微粉样品巴布剂均明显优于普通粉样品巴布剂。

3 讨论

3.1 关于流动相的选择

按照《中国药典》2010年版中血竭素的的含量测定方法进行操作，参考有关文献报道，比较了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（35∶65、40∶60、45∶55、50∶50）多种不同配比[3-8]，结果乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）作为流动相时能够将血竭素与杂质峰完全分离，出峰时间适当，峰形好。

3.2 关于血竭素定容方法

血竭素为色原酮类化合物，性质不稳定，见光易分解，溶液放置颜色会逐渐加深。因此待测样品溶液制备后立即置棕色量瓶中，用3%磷酸甲醇替代《中国药典》2010年版中的甲醇进行定容，使样品中的血竭素形成血竭素的磷酸盐，增强其稳定性[9-10]。稳定性试验考察结果表明，同一供试品溶液在0、1、2、4、6 h时峰面积积分值RSD为1.14%，表明血竭素的磷酸盐在甲醇溶液中6 h内室温下放置是稳定的。

3.3 关于供试品溶液制备

巴布膏剂含量测定难点在于排除基质的干扰，同时最大限度提取转移目标成分。由于六白白疕巴布剂组方药物中的甘草所含甘草酸易与血竭素形成盐，影响血竭素在脂溶性溶剂中的溶解和转移。参考文献报道[11]，对供试品溶液提取检测方法进行考察。结果发现，一定量氨试液既可浸润溶解巴布膏膏体，同时又能碱化、游离血竭素的甘草酸盐，减少其他水溶性成分和基质的影响。提高血竭素在三氯甲烷等溶剂中的提取转移率，实验结果表明，用膏体10倍的氨试液先浸润溶胀巴布膏体，使血竭素甘草酸盐在碱性环境下游离，再用三氯甲烷提取，可以增加血竭素在三氯甲烷相中的溶解转溶，残留膏体未能检测出血竭素成分。表明此法可以基本提取转溶血竭素成分，含量测定精确性高。

3.4 关于超微粉碎

中药材超微粉碎后，可使大部分药材细胞壁膜破裂，有效成分不必经过壁、膜的释放过程，直接暴露在外，有利于提高有效成分的溶出和透皮吸收效果[12-18]；在外用贴膏剂中，由于超微细粉的粒径小，一方面易于从基质材料中渗透出来，另一方面填充在基质中可以减少基质之间的相互作用力，有利于成分释放，提高释药速率[13]。本项研究中，血竭作为组方中的贵重药，在巴布剂剂型研究中替代硅藻土等用作填充剂，可以提高巴布剂药物成分相对比例。本研究结果表明，以血竭素不同时段体外透皮释药量为指标，超微细粉明显优于普通细粉，与有关研究报道等[13-18]研究结论基本一致，为中药以超微粉作为填充剂的外用贴膏剂制剂研究提供了一个新的思路。

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（收稿日期：2014-05-24 本文编辑：卫 轲）