荧光分析法测定元宝枫叶中总黄酮含量的研究

马登磊 邵建群 何深知 张 枫*

(1.首都医科大学化学生物学与药学院实验教学中心，北京100069;2.首都医科大学宣武医院药物研究室，北京100053)

元宝枫(Acer truncatum Bunge)又叫五角枫，属槭树科槭树属落叶乔木，是中国特有的树种。元宝枫叶中含有黄酮、多酚、绿原酸等多种化学成分［1-3］，而黄酮类物质是其重要的活性成分之一。近年来的研究［4-5］显示，不仅元宝枫叶提取物中黄酮类物质具有较强的自由基清除能力和抗氧化性，而且还对治疗肥胖的潜在靶点脂肪酸合酶有较强的抑制作用［6－7］，因而研究元宝枫叶黄酮类物质的测定方法是非常必要的。

目前分析测定黄酮的方法有紫外分光光度法和高效液相色谱法［8-10］。高效液相色谱法虽然精度高，但适用于黄酮单体的定量分析，而总黄酮含量的测定主要采用紫外分光光度法。现有的研究［11-12］显示，用硝酸铝紫外分光光度法测定总黄酮时，绿原酸的存在可能对结果有干扰，因邻二酚类结构与Al3+形成稳定结构，并使测定的总黄酮含量偏高。由于元宝枫叶提取物中除含有黄酮，还含有绿原酸等其他物质，所以必须设法降低绿原酸对测定结果的干扰。根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合物的特性，本文采用了荧光分析法并对测定元宝枫叶中的总黄酮含量进行了多方面的实验，希望本研究所建立的方法能为元宝枫叶中总黄酮含量测定提供参考。

1 实验方法

1.1 仪器

F-2500型荧光分光光度计(日本岛津公司);TGL-16型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂);KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);石英比色皿(宜兴市晶科光学仪器有限公司);BT25S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 材料

芦丁标准对照品(中国药品生物制品检定所，0080－9705);绿原酸标准对照品(中国药品生物制品鉴定所，110753－200212)。分析纯试剂有三水合乙酸钠(西陇化工股份有限公司);硝酸铝(北京现代东方精细化学品有限公司);无水乙酸(北京化工厂)，无水乙醇(北京化工厂)。水为蒸馏水，元宝枫落叶采自陕西杨陵(粉碎机磨碎并过40目筛)。

1.3 芦丁标准溶液的制备

精密称取芦丁对照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解定容，准确吸取此溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸钠缓冲液3 mL。用60%乙醇定容，摇匀，即配成标准工作溶液。

1.4 样品溶液的制备

称取元宝枫叶细粉1g于锥形瓶中，加入60%乙醇30 mL，室温条件下超声提取30 min，然后12 000 r/min离心6 min。取上清液置于另一个锥形瓶中，室温避光保存，此为元宝枫叶提取液的样品溶液。

测定时，吸取100 μL样品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸－醋酸钠缓冲液3 mL。用60%乙醇定容，摇匀，即配成样品工作溶液。

1.5 总黄酮含量测定

在激发光谱通带宽度5 nm，发射光谱通带宽度5 nm，激发波长λ=470 nm，发射波长λ=547 nm的条件下，测定芦丁标准工作溶液的荧光强度，以荧光强度对相应的浓度作图，绘制标准曲线，然后在相同的条件下测定样品溶液的荧光强度，再根据回归方程求出含量。同时，按选定的实验方法即60%乙醇为溶剂，加入1 mL 5%Al(NO3)3，调样品溶液 pH=5，对样品溶液进行了相关的方法学考察研究。

2 结果

2.1 荧光化合物的激发和发射光谱

按照实验方法选择光谱通带宽度5 nm，对芦丁溶液的激发和发射光谱进行扫描。考虑到绿原酸对荧光的影响，本实验本着尽量避开绿原酸的影响并且保证获得较好的发射光谱的原则，选择的激发和发射波长为470 nm和547 nm。

2.2 测定条件的选择

2.2.1 溶剂浓度的影响

黄酮类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂。本实验选择常用于植物中黄酮提取的乙醇作为溶剂，并考察不同体积分数的乙醇对荧光强度的影响。图1为加入5%硝酸铝溶液1 mL，pH=5的测定结果，此图表明乙醇的体积分数越大，芦丁的荧光强度越大。考虑到乙醇体积分数越大，挥发性越大，实验操作中对测定产生影响也会变大，本实验选择了60%乙醇溶液作为溶剂。

图1 乙醇体积分数对荧光强度的影响Fig.1 Effects of different ethanol concentration on the fluorescence intensity

2.2.2 Al(NO3)3加入量的影响

黄酮类化合物与铝离子可生成稳定的荧光配合物，Al(NO3)3的用量可对荧光强度造成影响。在10 mL的容量瓶中，加入一定质量浓度的芦丁标准溶液，分别加入 5%Al(NO3)3溶液为 0、0.5、1、1.5、2、3 mL，以60%的乙醇为溶剂，pH=5时测定各溶液的荧光强度值，图2的结果表明，当5%Al(NO3)3溶液用量为0.5 mL和1 mL时荧光强度较大。本实验选择采用加入5%Al(NO3)3为1 mL。

图2 5%硝酸铝溶液用量对荧光强度的影响Fig.2 Effects of dosage of 5%Al(NO3)3 solution on the fluorescence intensity

2.2.3 溶液pH值的影响

不同酸度的溶液会对黄酮类化合物与铝离子生成配合物的稳定性，以及荧光强度产生影响。以60%的乙醇为溶剂，加入5%硝酸铝溶液1 mL，采用醋酸－ 醋酸钠为缓冲液，配制 pH 值分别为2、3、4、4.5、5、6的芦丁测定溶液，并进行荧光强度测定。根据图3结果，随着pH值的增加，荧光强度也在增大。由于pH=6时测定溶液中有沉淀出现，故实验选择pH=5作为测定溶液的酸度，即在10 mL中加入pH=5的醋酸－醋酸钠缓冲液3 mL。

图3 溶液pH值对荧光强度的影响Fig.3 Effects of the solution acidity on the fluorescence intensity

2.2.4 放置时间的影响

在上述实验条件下，将芦丁的测定溶液静置于室内，并避免阳光直射。在不同时间测定溶液的荧光强度。由图4可知，在静置120 min内荧光强度变化不大，这说明在本实验条件下所配制的溶液很稳定。考虑到实验方法的一致性，选择放置30 min后测定荧光强度。

图4 静置时间对荧光强度的影响Fig.4 Effects of standing time on fluorescence intensity

2.2.5 绿原酸的影响

元宝枫叶提取物中含有绿原酸，绿原酸为3－咖啡酰奎尼酸，分子结构中含有邻二酚羟基，也可与Al3+形成配合物而发出荧光，从而对黄酮含量的测定产生影响。为了考察绿原酸对黄酮测定的影响，选择不同的激发波长，对样品中加入不同质量浓度的绿原酸进行对比分析研究。

表1中的第1组数据是未加绿原酸的样品溶液荧光强度值，ΔF值分别是第2、3组加绿原酸与第1组未加绿原酸荧光强度数值的差值。从表1可以看出，在元宝枫叶提取物的样品溶液中加入绿原酸之后，其荧光强度会变大。为了尽可能减少绿原酸的影响，并确保测定结果的准确性，实验选择了ΔF值变化相对较小的470 nm为激发波长。

由于绿原酸的存在，是可能导致对元宝枫叶提取物中总黄酮含量测定结果偏高的原因，图5和图6分别为绿原酸与Al3+结合后，在λem=547 nm扫描的激发光谱和在λex=470 nm扫描的荧光光谱(发射光谱)。从图5的激发光谱图可以看到，激发波长需要大于450 nm，才可以降低绿原酸在547 nm处的荧光强度。图6的荧光光谱图可知，在波长大于490 nm的范围内，绿原酸与Al3+结合所产生的荧光强度已很低。

2.3 标准曲线及方法检出限

实验表明，芦丁质量浓度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L的范围内与荧光强度具有良好的线性关系，其线性回归方程为:y=1.147 7x+0.430 4，

表1 绿原酸对荧光强度的影响Tab.1 Effects of chlorogenic acid on fluorescence intensity

式中:y表示荧光强度，x表示芦丁的质量浓度(μg/mL)，相关系数 R2=0.999 1。对空白对照液进行11次平行测定，根据公式CL=3S/K计算，方法检出限为1.36×10－7mol/L。

图5 绿原酸在λem=547 nm处的激发光谱Fig.5 Excitation spectrum of chlorogenic acid at λem=547 nm

图6 绿原酸在λex=470 nm的荧光(发射)光谱Fig.6 Fluorescence(emission)spectrum of chlorogenic acid at λex=470 nm

2.4 样品测定及回收率实验

按选定的实验方法，测定了元宝枫叶提取物中总黄酮的含量，并对样品溶液进行了平行测定(n=5)，结果见表2。为了验证实验的准确性，在样品溶液中加入芦丁对照品进行回收率实验，实验结果见表3。

表2 元宝枫叶中总黄酮含量Tab.2 Contents of total flavonoid in the leaves of Acer truncatum Bunge (n=5)

表3 样品回收率实验结果Tab.3 Results of the recovery test of samples (n=5)

3 结论

本文采用荧光分析方法，测定元宝枫叶中总黄酮的含量。分别考察了乙醇体积分数、5%Al(NO3)3的加入量、pH大小、放置时间以及绿原酸对荧光强度的影响。由于绿原酸的存在，是可能导致对元宝枫叶提取物中总黄酮含量测定结果偏高的原因。故本实验通过改变激发波长，从而减小绿原酸产生的荧光，进而减弱其对测定的影响。实验表明芦丁质量浓度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L与荧光强度具有良好的线性关系，回归方程为 y=1.147 7x+0.430 4，R2=0.999 1，检出限为1.36 ×10－7mol/L。

由于荧光分析法相对于紫外－可见分光光度法灵敏度高，而且本研究方法在稳定性、准确度和精密度方面符合要求，实验操作方法简便易行。因此，可以作为测定元宝枫叶总黄酮含量的参考方法。

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