合并中枢神经系统机会性感染患者的中枢HIV-1载量和变异性增高

刘远志 陈兵刚 丁 渭 乔录新 赵青霞 吴 昊 陈德喜 张玉林*

(1.首都医科大学附属北京佑安医院感染中心，北京100069;2.山东省滨州市中心医院感染内科，山东滨州251700;3.北京市肝病研究所，北京100069;4.河南省传染病医院感染科，郑州450015)

中枢神经系统(central nervous system，CNS)机会性感染(opportunistic infections，OIs)是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者最严重合并症之一［1］。虽然高活性抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)显著改善HIV感染者生存期和生活质量，但是CNS OIs仍然是这类患者预后不良的重要因素［2-3］。

笔者之前报道［4-5］了我国河南献血人群中枢神经系统HIV-1亚型主要是B或B'，针对gp120 C2-V5区序列分析提示外周血病毒准种变异性明显高于CNS，HIV-1合并神经认知障碍者中枢HIV-1病毒准种变异性也明显增高［6-7］。本研究中，笔者将对合并中枢神经系统机会性感染患者中枢HIV-1 gp120 C2-V5区序列进行分析，研究HIV-1病毒学特征，并探索其与中枢神经系统机会性感染的关系。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

研究对象为40例输血感染HIV-1且处于艾滋病期人群。其中，24名来自河南省传染病医院的艾滋病患者确诊合并中枢神经系统机会性感染。排除标准包括年龄小于18岁，有先天性或慢性神经系统疾病、慢性代谢疾病、脑血管疾病及脑瘤病史等。此外，16个未患中枢神经系统机会性感染来自相同人群的HIV-1感染者作为对照组。该项研究经首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会审核批准，所有患者均签署书面知情同意。

1.2 临床评估和HIV-1病毒载量检测

HIV-1感染通过酶联免疫吸附试验和免疫印迹法确诊。依据《美国成人和青少年HIV合并机会性感染防治指南》［8］，根据患者临床症状、体征、影像学和病原学检查进行诊断。弓形虫脑炎根据神经系统症状体征;头部CT扫描显示颅内多发环形病灶;血清抗弓形虫IgG抗体进行性升高;结合弓形虫肺部感染、心包炎和弥漫性弓形虫病等进行诊断。隐球菌脑膜炎可出现发热、头痛、颈项强直、视力障碍和意识障碍等症状，脑脊液压力显著增高;脑脊液墨汁染色和血清乳胶凝集试验阳性进行诊断。巨细胞病毒脑炎可根据神经系统症状隐匿或不典型，但较少出现发热、头痛症状;头部CT和MRI检查可见双侧大脑半球炎、脑室炎、脑膜炎和脑梗死、脑萎缩、脑积水等;增强扫描显示室管膜强化，表现为环形病灶;主要结合血清巨细胞病毒抗原阳性及脑脊液PCR检测综合评估诊断。进行性多灶性脑白质病可出现偏瘫或轻瘫导致的肢体无力、步态不稳、认知功能障碍和构音障碍症状;CT表现为脑白质多灶性低密度影;MRI检查T2WI序列呈高信号，增强后病灶无强化或仅病灶周围出现轻度强化;脑脊液JC病毒PCR检测协助诊断。临床和实验室数据包括性别、年龄、HIV-1感染时间、HAART时间、血白细胞计数、脑脊液细胞计数、脑脊液生化指标等。CD4+T细胞计数通过流式细胞术进行(BD FACS CantoMⅡ)。血浆和脑脊液的HIV-RNA水平通过RT-PCR测量(罗氏Amplicor，v.1.5，检测下限50 Copys/mL)。

1.3 脑脊液HIV-1 RNA gp120 C2-V5区扩增

CSF HIV-1 RNA纯化提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(Qiagen，Duesseldorf，德国)，依照厂商提供的说明书操作;提取的RNA迅速通过SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System反转录试剂盒(Invitrogen，California，USA)反转录(RT-PCR)为cDNA，具体步骤按照生产厂家提供的说明书操作。注意操作过程中标本的交叉污染。上述cDNA通过PCR反应扩增其中的C2-V5区核苷酸序列，应用成对设计引物的巢式PCR，引物序列:外侧正向引物:5'－atgggatcaaagcctaaagccatgtg－3'，外侧反向引物:5'－gcgcccatagtgcttcctgctgctgc－3'，内侧正向引物:5'－ctgttaaatggcagtctagc－3'，内侧反向引物:5'－acttctccaattgtccctcat－3'。采用常规反应体系和反应程序。设立多组阴性对照，检测实验过程中可能出现的模板污染。PCR产物通过TA载体进行分子克隆(Takara大连，中国)。每一标本随机选择6～8个克隆，然后用ABI3730遗传分析系统测序。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料和临床特征

24例中枢神经系统机会性感染者和16个感染HIV-1的对照组患者都是在1994和1995年期间通过献血染病，他们在2008年1月至2012年12月间作为中枢神经系统机会性感染者或是非中枢神经系统机会性感染者(对照组)参加研究，当时他们的CD4计数都低于200个 /mm3。24名中枢神经系统机会性感染者包含11名弓形虫脑炎、5名隐球菌脑膜炎、6名巨细胞病毒脑炎和2名进行性多灶性脑白质病。依据美国疾病预防控制中心分类标准，24例实验组患者均进入C3期，16例对照组患者属于B3期。所有患者都进行免费联合抗病毒治疗，治疗方案包括2个核苷反转录酶抑制剂(拉米夫定和齐多夫定)联合一个非核苷反转录酶抑制剂(奈韦拉平)。24名中枢神经系统机会性感染者同时接受抗感染治疗及对症治疗。患者年龄、性别、HIV-感染时间、联合抗反转录病毒治疗(combined antiretroviral therapy，cART)时间、白细胞计数和脑脊液生化指标:白细胞计数、蛋白质、葡萄糖和氯化物详见表1。其中实验组患者男性15例，女性9例，平均年龄为(46.56±21.45)岁。实验组与对照组之间年龄、性别比例、HIV-1感染时间和白细胞计数差异无统计学意义，但实验组接受联合抗反转录病毒治疗时间较短。此外，实验组脑脊液白细胞计数和蛋白质浓度较高，葡萄糖浓度较低。

表1 一般资料和临床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

表1 一般资料和临床特征Tab.1 The participants'demographic and clinical characteristics (±s)

HIV-1:human immunodeficiency virus type 1;cART:combined antiretroviral therapy;CSF:cerebro-spinal fluid;CNS:central nervous system;OIS:opportunistic infection;NS:not significant.

Item Control(n=16) CNS OIs(n=24)P Age/a 49.63±25.31 46.56±21.45 NS Male/n(%) 7(43.75) 15(62.5) NS HIV-1 infection time/a 16.44±2.38 17.34±1.81 NS cART time/months 16.38±6.45 3.26±1.73 P＜0.05 White blood cells/(×109·L－1) 6.45±3.16 5.87±2.56 NS White blood cells count in CSF/(×106·L－1) 3.47±2.64 23.54±13.68 P＜0.05 Protein in CSF/(g·L－1) 0.58±0.24 3.69±2.98 P＜0.05 Glucose in CSF/(mmol·L－1) 3.849±2.47 1.53±1.23 P ＜0.05 Chloride in CSF/(mmol·L－1) 128.470±70.54 103.22±81.46 NS

2.2 中枢神经系统机会性感染患者的脑脊液病毒载量明显增高

实验组血浆平均HIV载量(HIV RNA log10 copies/mL)为3.60±1.26，CSF为 6.09± 2.43;而对照组血浆平均HIV载量2.59±1.45，CSF为0.26 ±0.21。两组间血浆HIV载量无差别，但实验组CSF HIV载量明显高于对照组(图1A)。实验组和对照组CD4细胞计数，差异无统计学意义(图1B)。对照组脑脊液与血浆HIV载量(图1C)，以及实验组脑脊液和血浆中HIV载量都没有线性相关性(图1D)。同样，对照组CSF HIV载量与CD4计数(图1E)，以及实验组CSF HIV载量与CD4计数之间无线性相关性(图1F)。同时，实验组CSF HIV载量和CSF炎性反应指标:白细胞计数、蛋白质、葡萄糖和氯化物之间也没有相关性。

2.3 中枢神经系统机会性感染患者脑脊液HIV-1准种变异性增加

本研究从24例实验组和16例对照组患者脑脊液中分离了病毒RNA，然后扩增C2-V5(env)区。在TA克隆法和测序后，实验组总共获得114个阳性克隆，包括弓形虫脑炎58个，隐球菌性脑膜炎25个，巨细胞病毒脑炎23个和进行性多灶性脑白质病8个;对照组获得76个阳性克隆。通过Mega 5.0软件包将获得的序列与从GenBank获取的参考序列15_01B.TH99.99TH_MU2079_ACC_AF516184进行比对，建立相邻进化树(图2A)。通过测定各序列与标准序列之间的核苷酸距离，并进行统计学分析，发现实验组病毒变异性明显高于对照组(P＜0.000 1)(图2B)。

图1 血浆、脑脊液病毒载量及CD4细胞计数之间关系Fig.1 The correlation of plasma viral load and cerebrospinal fluid viral load and CD4 count

图2 HIV C2-V5区序列进化树及两组序列与参照株之间核苷酸距离比较Fig.2 Diversity of CSF HIV-1 quasispecies in patients with CNS OIs

3 讨论

HIV通过感染CD4细胞侵犯机体免疫系统，最终可产生全身多系统机会性感染，其中中枢神经系统的机会性感染较为常见［9］，病原学种类多，病情危重，病死率高［10］。中枢神经系统机会性感染通常发生在脑脊液。CD4细胞计数小于200个 /mm3［2］者 HIV-1 RNA的检测率在那些脑脊液CD4计数低于200个/mm3，以及血浆中能检测出HIV-1 RNA的患者中较高［11］。此前也有报道［12］患有神经系统疾病的患者脑脊液病毒载量较高，但是血浆病毒载量并不高。此外，脑脊液病毒检出率也与是否接受抗病毒治疗有关。本研究中，笔者还发现神经系统机会性感染患者脑脊液病毒载量较高，但与血浆病毒载量和CD4细胞计数无明显相关性。抗病毒治疗对脑脊液病毒载量影响似乎大于血浆(当然这需要大样本的研究进一步证实)。此前有报道［13］脑脊液HIV-1 RNA的水平和脑脊液的单核细胞计数之间有紧密关系，但本研究并未发现这一点。

HIV病毒准种变异性与神经系统疾病的相关性尚不确定［14］。笔者既往报道［4-5］HIV 感染者血浆病毒C2-V5区变异性明显高于脑脊液。HIV合并神经认知障碍患者中枢病毒变异性明显增高［7］。HIV相关中枢神经损伤与外周感染的HIV透过血-脑脊液屏障进入并定植于 CNS，产生炎性反应密切有关［15］。由于表面缺乏HIV感染所必需的CD4受体，神经元本身一般不感染HIV。由此，感染HIV的炎性反应细胞(包括CD4+淋巴细胞，单核/巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞)在HIV病毒与神经元之间建立起了损伤的纽带。上述感染了HIV-1的炎性反应细胞可释放病毒颗粒和炎性反应介质，进而通过神经元表面的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)和趋化因子受体等激活细胞表面和内质网钙离子通道，导致细胞内钙超载和超氧离子增多，诱导神经元凋亡［16-20］。笔者既往研究［4-5］发现中枢HIV-1病毒CCR5嗜性，变异性小于外周。gp120 V3环多肽可诱导原代培养的小鼠皮质神经元细胞凋亡，并抑制神经突起的形成［21］。艾滋病患者脑脊液超氧离子增加，尸检大脑皮质组织标本氧化损伤明显［7］。由此可见，HIV病毒启动中枢神经炎性损伤，并扮演重要角色。在本研究中，笔者发现中枢神经系统机会性感染患者的脑脊液病毒膜区变异性明显增高，这也许与中枢神经系统机会性感染的形成及病情进展相关。由此可见，病毒启动——炎性反应介导——神经损伤正是HIV神经病变(包括中枢神经系统机会性感染性病变)发病机制的主要路径。其中每一个环节的确切机制仍需深入研究，这也正是我们目前和将来的研究方向。

［1］Opportunistic Infections Project Team of the Collaboration of Bbservational HIV Epidemiological Research in Europe C01.CD4 cell count and the risk of AIDS or death in HIVInfected adults on combination antiretroviral therapy with a suppressed viral load:a longitudinal cohort study from COHERE［J］.PLoS Med，2012，9(3):e1001194.

［2］Tan I L，Smith B R，Von Geldern G，et al.HIV-associated opportunistic infections of the CNS［J］.Lancet Neurol，2012，11(7):605-617.

［3］Riveiro-Barciela M，Falcó V，Burgos J，et al.Neurological opportunistic infections and neurological immune reconstitution syndrome:impact of one decade of highly active antiretroviral treatment in a tertiary hospital［J］.HIV Med，2013，14(1):21-30.

［4］Wei F，Wang X，Liu L，et al.Characterization of HIV type 1 env gene in cerebrospinal fluid and blood of infected Chinese patients［j］.AIDS Res Hum Retroviruses，2011，27(7):793-796.

［5］Liu L，ZhAO Q，Wei F，et al.Genetic analysis of HIV type 1 env gene in cerebrospinal fluid and plasma of infected Chinese paid blood donors［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2012，28(1):106-109.

［6］Zhang Y，Qiao L，Ding W，et al.An initial screening for HIV-associated neurocognitive disorders of HIV-1 infected patients in China［J］.J Neurovirol，2012，18(2):120-126.

［7］Zhang Y，Wang M，Li H，et al.Accumulation of nuclear and mitochondrial DNA damage in the frontal cortex cells of patients with HIV-associated neurocognitive disorders［J］.Brain Res，2012，1458:1-11.

［8］Masur H，Kaplan J E.New guidelines for the management of HIV-related opportunistic infections［J］.JAMA，2009，301(22):2378-2380.

［9］宋凤丽，张玉林，乔录新，等.中国HIV-1感染人群神经认知损害初步筛查［J］.首都医科大学学报，2012，33(5):610-615.

［10］Mocroft A J，Lundgren J D，d'Armino Monforte A，et al.Survival of AIDS patients according to type of AIDS-defining event.The AIDS in Europe Study Group［J］.Int J Epidemiol，1997，26(2):400-407.

［11］Christo P P，Greco D B，Aleixo A W，et al.Factors influencing cerebrospinal fluid and plasma HIV-1 RNA detection rate in patients with and without opportunistic neurological disease during the HAART era［J］.BMC Infect Dis，2007，7:147.

［12］Christo P P，Greco D B，Aleixo A W，et al.HIV-1 RNA levels in cerebrospinal fluid and plasma and their correlation with opportunistic neurological diseases in a Brazilian AIDS reference hospital［J］.Arq Neuropsiquiatr，2005，63(4):907-913.

［13］Martin C，Albert J，Hansson P，et al.Cerebrospinal fluid mononuclear cell counts influence CSF HIV-1 RNA levels［J］.J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol，1998，17(3):214-219.

［14］van Marle G，Power C.Human immunodeficiency virus type 1 genetic diversity in the nervous system:evolutionary epiphenomenon or disease determinant［J］.J Neurovirol，2005，11(2):107-128.

［15］Persidsky Y，Gendelman H E.Mononuclear phagocyte immunity and the neuropathogenesis of HIV-1 infection［J］.J Leukoc Biol，2003，74(5):691-701.

［16］Wu D T，Woodman S E，Weiss J M，et al.Mechanisms of leukocyte trafficking into the CNS［J］.J Neurovirol，2000，6(Suppl 1):82-85.

［17］Gras G，Kaul M.Molecular mechanisms of neuroinvasion by monocytes-macrophages in HIV-1 infection［J］.Retrovirology，2010，7:30.

［18］Wang H，Sun J，Goldstein H.Human immunodeficiency virus type 1 infection increases the in vivo capacity of peripheral monocytes to cross the blood-brain barrier into the brain and the in vivo sensitivity of the blood-brain barrier to disruption by lipopolysaccharide［J］.J Virol，2008，82(15):7591-7600.

［19］Haughey N J，Mattson M P.Calcium dysregulation and neuronal apoptosis by the HIV-1 proteins Tat and gp120［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2002，31(Suppl 2):55-61.

［20］Wang Z，Pekarskaya O，Bencheikh M，et al.Reduced expression of glutamate transporter EAAT2 and impaired glutamate transport in human primary astrocytes exposed to HIV-1 or gp120［J］.Virology，2003，312(1):60-73.

［21］Zhang Y，Shi Y，Qiao L，et al.Sigma-1 receptor agonists provide neuroprotection against gp120 via a change in bcl-2 expression in mouse neuronal cultures［J］.Brain Res，2012，1431:13-22.