上颌快速扩弓腭中缝血管内皮生长因子的时空表达与新骨形成的相关性研究

张卫兵　王林

[摘要] 目的 探讨上颌快速扩弓扩张期和固定期兔腭中缝组织血管内皮生长因子（VEGF）的时空表达模式以及新骨形成情况。方法 将44只新西兰大白兔随机分为11组：实验组（共5组）、对照组（共5组）、对照0组，每组4只。用螺旋分裂基托扩大矫治器（Haas矫正器）扩张兔上牙弓，快速扩张2周，固定4周。在安装扩张器当天（对照0组）、快速扩张第1、2周、固定第1、2、4周（实验组和对照组）取兔上颌骨腭中缝组织块，采用免疫组织化学法检测VEGF在腭中缝组织中的分布和表达变化，采用过碘酸-Schiff染色法观测新骨形成。结果 快速扩张的腭中缝可见高水平的VEGF表达，VEGF阳性信号主要定位于血管内皮细胞胞浆和增殖活跃的成骨细胞胞浆。对照组VEGF在整个实验过程中均呈弱阳性表达。实验组快速扩张第1周、快速扩张第2周、固定第1周、固定第2周VEGF蛋白表达量均高于对照组。随着机械应力快速扩张，实验组VEGF蛋白表达量逐渐上升，固定1周达峰值后逐渐下降。实验组新骨形成的量均高于对照组，新骨形成的量逐渐上升，固定2周达峰值后逐渐下降。结论 上颌快速扩弓产生的机械牵张力可以导致VEGF生成增加从而促进血管及新骨的生成。

[关键词] 上颌快速扩弓； 血管内皮生长因子； 免疫组织化学； 新骨形成

[中图分类号] R 783.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.007

上颌快速扩张腭中缝的愈合过程受到多种因素的调节，研究[1-2]表明，转化生长因子、骨形成蛋白等在上颌快速扩张腭中缝组织改建过程中起重要的调控作用。然而，上颌快速扩张腭中缝牵张成骨是一个血管生成依赖性过程，在骨改建中需要有足够的血运供应，而且血管生成要早于新骨形成。研究[3]发现血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成和新骨形成中扮演十分重要的角色，但是其在上颌快速扩张腭中缝组织改建过程中的作用尚未见报道。本课题拟采用兔上颌快速扩张模型，用免疫组织化学方法检测VEGF在腭中缝组织中的分布和表达变化，并采用过碘酸-Schiff（periodic acid-Schiff，PAS）染色法观测新骨形成，为研究VEGF与上颌快速扩张腭中缝牵张成骨的关系提供实验依据。

3 讨论

本研究免疫组织化学方法检测VEGF在腭中缝组织中的分布和表达变化的情况，采用PAS染色法观测新骨形成，来探讨VEGF在上颌快速扩张腭中缝牵张成骨中的生物学意义。

上颌快速扩张腭中缝牵张成骨的方式为膜内成骨，在腭中缝骨边缘部位血管增生，间充质细胞密集并分化为骨原细胞，其中部分骨原细胞成为成骨细胞，并且分泌出细胞间质的有机成分，形成类骨质，此过程为新骨形成。此时骨细胞间质（又称骨基质）的有机成分中富含有糖-蛋白质复合物[6]，经过碘酸的氧化，再与染色剂结合，能够清楚地显示为红色，所以PAS染色法[5]可用来显示新骨形成。

近年来关于血管生成在骨生长发育和修复再生中的意义越来越受到重视，现已证实新生血管的长入是骨发育、修复再生的必需过程[7]，骨组织重建或适应性增生依赖于新生毛细血管的快速形成与分布，新生血管形成对新骨形成起了关键作用[8-9]。

机械力调节骨缝生长如前方牵引施加矫形力于上颌颌周骨缝和上颌快速扩张腭中缝等，是经过一系列复杂的细胞和分子生物学行为完成的，涉及到诸如血管生成、间质细胞分化迁移、细胞外基质合成和矿化及骨改建等多个生理过程，且都由许多生长因子通过分子信号转导途径精细调节[10]。在矫形扩大骨缝组织的改建中，血管生成和骨生成是协调进行和相互影响的，新形成的血管促进新骨的形成，在新骨形成之前，首先发生的是血管的侵袭，新骨发生在新生的血管附近，血管转运骨祖细胞，分泌分裂原始成骨细胞，并提供养分和氧气[11]。VEGF则是血管生长的重要调节因子。VEGF是一种多功能的细胞因子，具有增加微血管通透性和促进血管内皮细胞增殖、迁移，诱导血管生成的作用[12]。VEGF还参与骨形成与代谢，Nakagawa等[13]研究表明阻断内源性VEGF的活性，骨形成与骨吸收就停止。VEGF可通过自分泌、旁分泌作用于成骨细胞和破骨细胞，在调节血管生成的同时，对骨组织的再生、修复发挥非常重要的作用。关于VEGF在上颌快速扩张腭中缝组织中的表达模式及作用尚不清楚。

本研究结果显示，實验组新骨形成的量均高于对照组，同时机械力刺激可以导致内源性VEGF的生成增加，实验组VEGF的表达水平显著高于对照组。在实验组中随着机械应力快速扩张，VEGF蛋白的表达量逐渐上升，第3周即固定第1周达峰值后逐渐下降。新骨形成则是从快速扩张第1周到固定第1周逐渐增加，在VEGF最高水平表达的1周后即固定第2周达峰值。牵张成骨过程中VEGF的显著表达同时伴随着新骨形成的增加，可见快速扩张兔腭中缝牵张成骨过程中VEGF的表达同新骨的形成呈正相关性。体外实验证实VEGF对培养的成骨细胞有促进趋化和增生的作用[14]，成骨细胞本身可表达VEGF，成骨细胞本身也表达其受体Flt-1和Flk-1[15]。VEGF既能以旁分泌，又能以自分泌作用方式调节成骨细胞功能。本研究中观察到在扩张第2周及固定第1、2周时成骨细胞VEGF染色强阳性，表明VEGF参与了快速扩张力作用下腭中缝组织的成骨调控活动。

实验组腭中缝组织中VEGF呈高水平表达，除定位于血管内皮细胞，还定位于增殖活跃的间充质细胞、成骨细胞。VEGF的分布广泛，表明其可能更多地参与和调节牵张成骨各个时期的细胞生物学行为。本研究组织学观察显示成骨细胞和血管床的内皮细胞紧密相邻，实验组腭中缝组织成骨细胞和血管内皮细胞VEGF染色强阳性，说明成骨和血管化是不可分割的。成骨细胞在缺氧的条件下分泌VEGF，VEGF有促进内皮细胞增殖和保护内皮细胞的作用，而内皮细胞又能合成分泌一系列可溶性调节因子，这些因子具有控制成骨细胞募集、增殖及分化等作用。成骨细胞和内皮细胞相互作用，促进血管化，带来养分和新的成骨细胞，完成骨组织的修复重建工作。

本研究结果提示VEGF在上颌快速扩张机械-生物信号传递以及细胞应答过程中扮演重要的角色。VEGF功能与新骨形成密切相关。也许可在施加扩张力后的腭中缝组织中，通过组织工程学技术局部施加外源性VEGF，或者通过基因技术使腭中缝组织的成骨细胞持续、稳定表达VEGF，以此来增强腭中缝组织的血管生成作用及骨缝改建中的成骨活动，促进大量新骨形成，提高矫治疗效的稳定性。

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（本文编辑 李彩）