牙周致病菌在患慢性牙周炎产妇脐带血中的检测

江国庆 祝军

【摘要】目的检测脐带血中的5种特异性牙周致病菌。方法收集64例患有慢性牙周炎（重度）产妇脐带血标本，采用Chelex-100法提取慢性牙周炎产妇脐带血中的DNA,并通过PCR分别检测脐带血中的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis,Tf)5种牙周特异性致病菌。结果64例患有慢性牙周炎产妇脐带血中牙龈卟啉单胞菌(Pg)的检出率为31%,福赛斯坦纳菌(Tf)42%,中间普氏菌(Pi)26%,具核梭杆菌(Fn)21%,伴放线放线杆菌(Aa)23%。这几种细菌的PCR产物通过测序,结果与GenBank数据库中的序列进行比对同源性达99%~100%。结论牙周致病菌在全身性促进因素中的遗传因素中可能发挥着一定的作用。

【关键词】慢性牙周炎；脐带血；牙周致病菌

【中图分类号】R722 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0105-01

慢性牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，导致牙周支持组织的炎症和破坏，如牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最后导致牙齿的松动和被拔除，引起牙周病有局部促进因素（牙石、解剖因素、不良修复体和不良正畸治疗、创伤性颌、食物嵌塞、不良习惯、牙面着色）和全身性促进因素（遗传因素、性激素、吸烟、有关的系统疾病，精神压力等）［1］。致病性微生物是引发牙周病必不可少的始动因素，也在全身性促进因素中的遗传因素中起到主要作用，即母亲患有慢性牙周炎，出生幼儿患有牙周炎的几率较高，主要与母婴传播有关［2］。研究发现原本定植于人类口腔的牙周致病菌在脐带血中有较高的检出率，表明牙周致病菌通过母婴垂直传播导致幼儿将来患有牙周病的几率大大提高。本研究本研究通过收集患有慢性牙周炎产妇脐带血标本,从脐带血标本中提取5种特异性牙周致病菌的DNA,采用特异性引物,通过PCR分别检测牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis,Tf)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)以及伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa),来探讨牙周致病菌在牙周病的全身性促进因素中的遗传因素中发挥着一定的作用。

1对象和方法

1.1研究对象：选择2012年3月至2013年4月在新疆医科大学第一附属医院产科患有慢性牙周炎的产妇64例，所有研究对象均签署知情同意书。慢性牙周炎的诊断标准：每名入选的产妇在术前一周由牙周专科医师测量全口牙周探诊深度(probing depth,PD)和牙周附着丧失(clinical attachment loss,CAL),参照Armitage等［3］推荐的诊断标准诊断牙周炎。

1.2标本采集：由产科医师在引产后收集脐带血,将收集的血液放入装有1 ml生理盐水溶液的无菌EP管中,-80℃冻存。

1.3主要试剂：5%Chelex-100(Sigma公司,美国);蛋白酶K(上海生工生物工程有限公司);2×TapPCR Master Mix(北京博迈德科技发展有限公司);5对牙周致病菌的16S rRNA特异性引物参照文献［4-6］由上海生工生物工程有限公司合成,分别为:牙龈卟啉单胞菌(Pg),上游引物序列5′-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3′,下游引物序列5′-ACGTCATC CACACCTTCCTC-3′,扩增的目的片段长度为197 bp,PCR反应退火温度57.2℃;福赛斯坦纳菌(Tf),上游引物序列5′-GTCGGACTAATACCTCATAAAACA-3′,下游引物序列5′-TCGCCCATTGACCAATATT-3′,扩增的目的片段长度为222 bp,PCR反应退火温度55℃;具核梭杆菌(Fn),上游引物序列5-GGCCACAAGGGGACTGAGACA-3′,下游引物序列5′-TTTAGCCGTCACTTCTTCTGTTGG-3′,扩增的目的片段长度为183 bp,PCR反应退火温度58.6℃;中间普氏菌(Pi),上游引物序列5′-GTGCTTGCACATTCTGGACGTCGAC-3′,下游引物序列5′-CGTCTGCAATTCAAGCCCGG GTAAG-3′,扩增的目的片段长度为923 bp,PCR反应退火温度61.8℃;伴放线放线杆菌(Aa),上游引物序列5′-GCTAATACCGCGTAGAGTCGT-3′,下游引物序列5′-ATTTCACACCTCACTTAAAGGT-3′,扩增的目的片段长度为442 bp,PCR反应退火温度60.7℃。阳性对照采用5种国际参考标准菌株(部分标准株由四川大学华西口腔医院卫生部重点实验室提供):牙龈卟啉单胞ATCC33277,中间普氏菌ATCC25611,具核梭杆菌ATCC25586,福赛斯坦纳菌ATCC43037,伴放线放线杆菌ATCC29523。菌株由新疆医科大学微生物实验室复活。

1.4主要设备：低温高速离心机(Thermo公司,美国),C1000型PCR扩增仪(Bio-Rad公司,美国),Gel Doc2000凝胶成像仪(Bio-Rad公司,美国),DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器厂),HHS型电热恒温水浴锅(北京博迅实业有限公司),TU-1901型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司),-80℃低温冰箱(Thermo公司,美国)。

1.5 DNA的提取：采用Chelex-100法提取臍带血中的DNA,用电子秤秤取100 mg脐带血并无菌操作剪碎,放入1.5 mlEP管中,然后用移液器在上述EP管中加入150μl(50 mg/ml)Chelex-100和4μl(20 mg/ml)蛋白酶K,用移液器反复吹打混匀,再用旋涡混合器混匀10 min。水浴箱中100℃水浴10 min,冰浴1min,离心半径5 cm,12 000 r/min离心10 min,上清液移至1.5 ml无菌EP管中,-20℃保存。

2结果

脐带血中5种特异性牙周致病菌的检出率:牙龈卟啉单胞菌(Pg)的检出率为31%,福赛斯坦纳菌(Tf)为42%,中间普氏菌(Pi)为26%,具核梭杆菌(Fn)为21%,伴放线放线杆菌(Aa)为23%。其中福赛斯坦纳菌(Tf)的检出率最高。

3讨论

随着现代医学的发展，人们对牙周病的发病机制有了更深入的了解。牙周病是一种微生物感染性疾病，致病性微生物是引发牙周病必不可少的始动因素。致病微生物可以通过局部的促进因素引起牙周炎，如：牙石，牙颈部的软垢；也可通过全身性促进因素引起牙周炎，如：遗传因素（母婴垂直传播）。在牙周炎过程中，牙周病原菌及其内毒素首先诱发局部牙周组织的免疫反应产生大量的炎性介质如IL-1、TNF-α，PGE-2及牙周致病菌的抗体［7］。随病情的进展，这些致病菌及毒素进入血液循环并达到胎盘，随之产生更多的炎性介质［8-9］。这些牙周病原菌及内毒素和炎性介质可以通过胎盘，进入胎儿的血液循环中，如果胎儿的免疫系统不能控制这种反应，则细菌及其毒素和炎性介质扩散至全身组织器官，从而诱发幼儿将来患有牙周病的可能性。

參考文献

［1］孟焕新.牙周病学［M］.人民卫生出版社,2008,第三版:61-78

［2］王勤涛.牙周病学［M］.人民卫生出版社,2010,第二版:95-96.

［3］Armitage GC,Wu Y,Wang HY,et al.Low prevalence of a periodontitis-associated interleukin-1 composite genotype in individuals of Chinese heritage.J Periodontol,2000,71(2):164-171.

［4］Cairo F,Gaeta C,Dorigo W,et al.Periodontal pathogens in atheromatous plaques.A controlled clinical and laboratory trial.J Periodontal Res,2004,39(6):442-446.

［5］Ashimoto A,Chen C,Bakker I,et al.Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions.Oral Microbiol Immunol,1996,11(4):266-273.

［6］Kimura S,Ooshima T,Takiguchi M,et al.Periodontopathic bacterial infection in childhood.J Periodontol,2002,73(1):20-26

［7］Tuomainen AM,Jauhiainen M,Kovanen PT,et al.Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces MMP-9 expression and proatherogenic lipoprotein profile in apoE-deficient mice.Microb Pathog,2008,44(2):111-117.

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［9］JawieńJ.New insights into immunological aspects of atherosclerosis.Pol Arch Med Wewn,2008,118(3):127-131.