纳米四氧化三铁模拟酶催化光度法测定食品中痕量双氧水*

刘细祥，欧阳辉祥，谢宇奇，凌绍明，兰翠玲

（百色学院化学与生命科学系，广西百色 533000）

双氧水（H2O2）是一种强氧化剂，具有良好的氧化、漂白、防腐和消毒等功能，在食品工业中，H2O2被广泛用于加工助剂和奶制品、食品纤维和食品包装材料的消毒杀菌。毒理学研究表明，当H2O2的浓度达到0.5 mmol/L时，可自然产生羟基自由基，氧化生物体细胞，导致疾病和加速衰老，对生物体有害。中国国家标准GB 2760—1996《食品添加剂使用卫生标准》中规定：H2O2只允许在生鲜牛奶和袋装豆腐干的生产过程中使用，且其成品中不得残留。因此，对食品中痕量H2O2的检测十分必要。

目前，检测H2O2主要基于酶（模拟酶）催化，检测的方法有电化学法［1］、流动注射分析法、色谱法、分光光度法、荧光法［2］和化学发光法［3］等。 天然酶试剂昂贵、不易储存、实验操作繁琐且受温度等多种因素影响，难以普及应用。近几年，纳米粒子催化性能的研究及分析应用十分广泛，研究证明小粒径的纳米金具有很好的催化性能［4］，以纳米金为催化剂建立起来的催化增强技术，大大提高了检测方法的灵敏度［5］。 2007 年，阎锡蕴研究小组［6］发现磁性纳米Fe3O4颗粒具有类过氧化物酶的催化功能，这一发现拓展了磁性纳米Fe3O4颗粒的应用范畴，使得纳米Fe3O4在过氧化物催化领域的应用成为一个热点［7-9］，但有关纳米Fe3O4催化氧化甲基橙分光光度法检测H2O2尚未见报道。笔者以甲基橙（MO）为底物，纳米Fe3O4模拟酶对过氧化氢氧化甲基橙褪色反应具有催化作用，据此建立了纳米Fe3O4催化氧化甲基橙测定痕量H2O2的新方法，该法兼有光度法的简便性、催化法灵敏度高和成本低等优点，应用前景广阔。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：UV 2700型双光束紫外-可见分光光度计、Quanta 200 FEG场发射扫描电子显微镜、SYZ-550型石英亚沸蒸馏水器、DK-8B型电热恒温水槽。

试剂：H2O2储备液8.8 mol/L（用高锰酸钾法标定），使用时用水稀释至所需浓度；FeCl3·6H2O；FeSO4·7H2O；1.00 mg/mL 甲基橙水溶液；pH 为 1.42的0.2 mol/L（以NaAc计）HCl-NaAc缓冲溶液。试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 纳米Fe3O4的制备

采用超声辅助反向共沉淀法制备Fe3O4：准确量取15 mL二次水于锥形瓶内，水浴加热至80℃，在强磁力搅拌下加入用5 mL二次水溶解过的2.025 g FeCl3·6H2O 和 1.475 g FeSO4·7H2O 混合溶液， 逐滴加入5 mL浓氨水，继续恒温搅拌1.5 h；冷却后强磁铁吸附分离，用二次水多次洗涤至中性，加水定容到100 mL，避光密封保存，Fe3O4的质量浓度为8.68 g/L。图1为纳米Fe3O4扫描电镜照片。结果表明，该纳米微粒平均粒径为20 nm。主要化学反应式：

图1 纳米Fe3O4扫描电镜照片

1.3 实验方法

在5 mL具塞比色管中，依次加入0.2 mL经超声波处理的0.868 g/L纳米Fe3O4溶胶、0.2 mL且pH为1.42的HCl-NaAc缓冲溶液和0.2 mL质量浓度为0.01 mg/mL甲基橙水溶液，加入一定量H2O2，用二次蒸馏水定容至1.5 mL，摇匀后放到60℃水浴锅中。15 min后取出，冰水冷却2 min后，强磁铁吸附分离，静置2 min，取上清液以水为参比，在506 nm处测定吸光强度（A），同时测定不加H2O2的空白溶液吸光度（A0），计算吸光度的差：ΔA=A0-A。

2 结果与讨论

2.1 方法原理

纳米Fe3O4具有过氧化物酶性质，在pH=1.42的HCl-NaAc缓冲溶液、60℃条件下催化分解H2O2产生羟基自由基，羟基自由基氧化底物MO得到无色混合产物（图 2）［10］，体系颜色由红色逐渐变浅，最终颜色完全褪去，导致体系在506 nm处吸光度减小，随着H2O2浓度的增加，生成的产物增多，吸光度差ΔA线性降低。据此可以建立一种简便灵敏检测H2O2的新方法。

图2 纳米Fe3O4催化氧化甲基橙褪色

2.2 紫外-可见吸收光谱

图3为纳米Fe3O4催化体系紫外吸收光谱图。在pH=1.42的介质中，MO水溶液在506 nm处有强吸收，加入纳米Fe3O4催化H2O2产生羟基自由基后，底物MO逐渐被羟基自由基氧化生成无色的产物，从而使体系在506 nm处的吸收信号不断降低。由图3可见，随着H2O2浓度的增大，各体系在506nm处的吸光度逐渐降低，说明MO被纳米Fe3O4模拟酶催化过氧化氢氧化褪色。综合考虑，实验选择506 nm处为测定波长。

图3 纳米Fe3O4催化体系紫外吸收光谱图

2.3 测定条件优化

2.3.1 HCl-NaAc缓冲溶液的影响

实验首先考察了缓冲溶液pH及用量对体系ΔA的影响。结果如图4、图5所示。由图4、5可以看出，当pH和HCl-NaAc用量分别为1.42和0.2 mL时，ΔA可达到最大值。因此，实验选用pH=1.42的HCl-NaAc缓冲溶液0.2 mL。

图4 pH对吸光度差的影响

图5 HCl-NaAc缓冲溶液用量对吸光度差的影响

2.3.2 纳米Fe3O4催化剂用量的影响

按照1.3节的实验方法，考察了纳米Fe3O4催化剂用量对体系ΔA的影响，结果见图6。由图6可见，最初随着催化剂用量增大，体系ΔA也增大，当催化剂用量达到0.2 mL时，ΔA达到最大；当用量超过0.2 mL时，体系ΔA反而下降，这可能是由于纳米Fe3O4的吸附作用致使体系A0减小，从而造成ΔA减小。因此，实验选择适宜的纳米Fe3O4用量为0.2 mL。

图6 纳米Fe3O4催化剂用量对吸光度差的影响

2.3.3 反应温度的影响

按照1.3节的实验方法，考察了不同反应温度对体系ΔA的影响，结果见图7。由图7可以看出，在30～60℃时，ΔA随着温度的升高而增大，说明温度升高，催化体系的反应程度加剧；当温度为60℃时，ΔA达到最大；温度大于60℃时，由于温度过高，H2O2自行分解加剧，从而造成体系ΔA降低。因此，实验选择最佳反应温度为60℃。

图7 催化反应温度对吸光度差的影响

2.3.4 反应时间的影响

按照1.3节的实验方法，考察了不同反应时间对体系ΔA的影响，结果见图8。由图8可知，当反应时间为15 min时，ΔA即达到最大值，继续增加反应时间，ΔA呈下降趋势。因此，实验选择最佳反应时间为15 min。

图8 催化反应时间对吸光度差的影响

2.4 共存物质的影响

按照1.3节的实验方法，在H2O2浓度为1.76 μmol/L的条件下，考察了共存物质对体系的影响。结果表明，相对误差不超过5%时，各干扰物质的共存量（倍）：F-、CO32-、K+、Cl-、Na+、NO32-、Al3+、Fe2+（1000），PO43-、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+（50）， 柠檬酸（500），抗坏血酸、乳酸（200）， EDTA、甲醛（25）。

2.5 线性关系

在最佳实验条件下，测定不同浓度的H2O2对应的ΔA，以浓度c对ΔA绘制标准曲线，实验结果表明，双氧水浓度在1.17～35.2 μmol/L范围内与ΔA存在良好的线性关系。回归方程为ΔA=0.0149c+0.0917，相关系数为r=0.9955，检出限为0.6μmol/L。

2.6 样品的分析

称取牛百叶50 g，浸于50 mL二次水中24 h，过滤取清液，于冰箱中冷藏保存，腐竹预处理方法与处理牛百叶方法相同，按实验方法测定样品中的H2O2，并对样品进行加标回收率实验，同时做空白加标实验（见表1）。由表1结果可知，在5次平行样品测定中，样品加标回收率为95.5%～98.3%，空白加标回收率为102.8%，结果令人满意。

表1 样品测定结果及回收率实验（n=5）

［1］Wang Gang，Xu Jingjuan，Chen Hongyuan，et al.Amperometric hydrogen peroxide biosensor with sol-gel/chitosan network-like film as immobilization matrix ［J］.Biosensors and Bioelectronics，2003，18（4）：335-343.

［2］ChenHongqi，YuHupeng，ZhouYunyou，etal.Fluorescentquenching methodfordeterminationoftracehydrogenperoxideinrainwater［J］.Spectrochin mica Acta PartA：Molecularand Biomolecular Spectroscopy，2007，67（3/4）：683-686.

［3］Marle L，Greenway G M.Determination of hydrogen peroxide in rainwater in a miniaturised analytical system ［J］.Anal.Chim.Acta，2005，548（1/2）：20-25.

［4］温桂清，梁爱惠，廖献就.检测痕量纳米金的纳米催化光度法［J］.分析测试技术与仪器，2008，14 （4）：195-198.

［5］Jiang Zhiliang，Liao Xianjiu，Deng Anping，et al.Catalytic effect of nanogold on Cu（Ⅱ）-N2H4reaction and its application to resonance scattering immunoassay［J］.Anal.Chem.，2008，80（22）：8681-8687.

［6］Gao Lizeng，Zhuang Jie，Nie Leng，et al.Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles and application in an immunoassay［J］.Nature Nanotechnology，2007，2（9）：577-583.

［7］Ouyang Huixiang，Wang Lisheng，Tian Jianniao，et al.A simple and sensitive nanocatalytic fluorescence method for the determination of folic acid in foods using Fe3O4nanoparticle-K2S2O8system ［J］.Food Analytical Methods，2013，6（1）：76-81.

［8］Ouyang Huixiang，Liang Aihui，Tian Jianniao，et al.Catalytic spectrophotometric determination of trace H2O2using Fe3O4nanoparticlesasperoxidasemimetics ［J］.AppliedMechanicsandMaterials，2013，319：39-42.

［9］Zhang Zhanxia，Wang Zhongjun，Wang Xiaolei，et al.Magnetic nanoparticle-linked colorimetric aptasensor for the detection of thrombin ［J］.Sensors and Actuators B：Chemical，2010，147 （2）：428-433.

［10］朱燕，郁志勇，孙震，等.过氧化氢存在下甲基橙光化学反应产物的鉴定［J］.甘肃科学学报， 2004，16（2）：44-46.