低温干燥过程中LEA-motif对热敏性药物胰岛素的活性保护研究

张 燕，李代禧，郭柏松，翟 振，刘 立，杨春生，余华星

(1.上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093;2.上海东富龙科技股份有限公司冻干工艺研究室，上海 201108)

胚胎发育晚期丰富蛋白［1］(LEA)是植物胚胎发育后期种子中大量积累的富含甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和其他亲水氨基酸的一类蛋白质，因此，LEA蛋白具有很高的亲水性以及热稳定性［2］。LEA蛋白的无序性使其在干燥时，能适应热敏性蛋白的形状，吸附在蛋白表面，形成保护层，防止热敏性蛋白的脱水变性、聚集变性和受热变性［3-4］。

为了验证LEA蛋白的保护性，我们选择典型的热敏性蛋白药物——胰岛素活性单体作研究对象，第3组 LEA蛋白(AaVLEA1)［5］的特征重复片段(LEA-motif，LEAM)作为保护剂，研究 LEA-motif对热敏性蛋白药物的干燥活性保护作用。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

猪胰岛素，医药级;LEA蛋白特征重复片段(LT130325-LT342888，纯度 95.47%);无水硫酸钠、乙醇胺、磷酸均为分析纯。

Waters e2695高效液相色谱仪;Waters e2695分离模块和Waters2998光电二极管检测器;LYO-0.2冻干机;XS205天平。

1.2 实验方法

胰岛素浓度为5 mg/mL，加入LEA-motif保护剂，其与胰岛素六聚体的摩尔比分别为1∶0，1∶3(即LEA-motif与胰岛素单体的摩尔比为 1∶0，1∶18)。

用冻干机进行冷冻干燥。首先将药物在－45℃预冻 1 h。然后抽真空，一次干燥温度－35℃，干燥室内真空度为0 Pa，干燥18 h。解析干燥温度为25℃，直至干燥过程结束，这个过程共持续6 h。冻干结束后，用橡皮塞封玻璃瓶，保存在冰箱中。

1.3 分析方法

1.3.1 胰岛素三维结构分析 胰岛素采用蛋白质数据库中的晶体结构(3inc［6］)作为初始结构，用Arguslab软件构建其三维分子模型。

1.3.2 效价分析 HPLC法［7］用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂(4.6 mm ×250 mm，5μm);以0.2 mol/L硫酸盐缓冲液(无水硫酸钠28.4 g加水溶解后加磷酸2.7 mL，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1 000 mL)-乙腈(74∶26)为流动相;柱温为40℃;检测波长为214 nm;流速1 mL/min。实验样品用0.01 mol/L盐酸溶液制成40 U/mL的溶液，注入液相色谱仪20μL，记录色谱图。另取胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算效价［8］。

2 结果与讨论

2.1 干燥前后胰岛素三维结构的变化

在干燥模拟后，在不同水分含量下，添加LEA-motif保护剂前后各个胰岛素的三维活性结构见表1。

表1 干燥后胰岛素的三维结构比较Table1 3D structures comparison of driedinsulin

由表1可知，没有LEA保护的胰岛素干燥后，整体结构发生很大变化，许多疏水残基外翻暴露于胰岛素单体的分子表面，α-螺旋明显减少，并大部分转化为无规则卷曲和β-扭转，三维结构彻底变形，而且这种变性趋势随着干燥程度的增加而增加，这样严重变性的胰岛素即使在水溶液中也不可能恢复到初始三维活性结构。然而，添加18 LEA-motif保护剂的胰岛素，随着水分含量的减少，胰岛素三维活性结构始终与初始结构没有明显区别，且二级结构也保持较好，LEA-motif对胰岛素的生物活性保护效果明显。

2.2 氨基酸残基B因子分析

B因子也被称为温度因子，反映蛋白质分子由于热振动和构象变化而引起的振动程度［9］。B因子越高，相应部位的构象就越不稳定，表示残基柔性越强［10］。图1为胰岛素主链上各氨基酸残基的B因子曲线图。

图1 水分含量为1.77%时，胰岛素主链B因子大小Fig.1 B-factor of insulin with water content of 1.77%

由图1可知，在相同状态下，β链上的数据跳跃更大，说明胰岛素β肽链氨基酸残基比α链上的更不稳定，残基柔性越强。未加保护剂的胰岛素两条肽链上的氨基酸残基B因子变换幅度大。这都说明，在干燥过程中，未加任何保护剂的胰岛素热稳定性差，易变形。

添加LEA-motif保护剂后，B因子大小明显降低很多，且振幅减弱，说明氨基酸残基更加稳定，残基部位刚性更强，说明LEA-motif在干燥过程中能维持胰岛素的三维活性结构以及二级结构，不因水分缺失而引起胰岛素结构变形。与前面分析的三维活性结构分析一致。

2.3 胰岛素体系内氢键分析

图2 水分子(A)和LEA-motif(B)分别与胰岛素之间的氢键数目曲线图Fig.2 H-bonding number between water(A)，LEA-motif(B)and insulin during desiccation

由图2可知，在干燥过程中，随着水分含量的减少，水分子与胰岛素之间的氢键急剧减少(图2A)，而保护剂与胰岛素之间形成的氢键显著增多(图2B)，说明LEA-motif能迅速适应缺水环境，形成适应胰岛蛋白的形状，较好的吸附在其表面，形成保护层，保护胰岛素不因缺水而受到伤害，很好地维持胰岛素的活性结构。这与水替代学说基本一致［11］。再者，蛋白质多肽主链中形成的氢键决定蛋白质的二级结构，LEA-motif保护的胰岛素，主链间的氢键数目比未加任何保护剂的胰岛素主链间的多(如图3A)，主链间形成的氢键可以保护胰岛素的二级结构不被破坏，维持三维活性结构的稳定性。

另外，未加保护剂的胰岛素随水分含量的减少，其分子内氢键增加显著(图3 B)，表明胰岛素分子内部无序连接的增大，无序连接增大会引起体积的皱缩和亲水面积的减小。这些现象均表明其整体三维结构发生了重大变化。

图3 胰岛素主链间(A)和胰岛素内(B)的氢键数目Fig.3 H-bonding number in insulin system during desiccation

2.4 效价分析

图4 是未加保护剂的胰岛素六聚体和添加3 LEA-motif的胰岛素六聚体体系(胰岛素单体与LEA-motif的摩尔比为1∶18)的3次平行实验结果的平均值所绘制的色谱图。图中第1个峰为LEA-motif特征峰，第2个峰为胰岛素特征峰，峰面积大小反应了胰岛素六聚体干燥后的活性结构保护效果。

图4 未加保护剂胰岛素和添加3 LEA-motif的胰岛素干燥后的色谱图Fig.4 HPLCcurves of various rehydrated insulin hexamer after dried

冻干胰岛素与初始胰岛素(初始猪胰岛素经高效液相色谱法测得的峰面积为28 146 905.67 μV·s，效价40 U)的效价比绘制的柱形图，见图5。

图5 添加LEA-motif的胰岛素与未加保护剂的胰岛素冻干后的活性变化Fig.5 Bioactivity of dried insulin in two insulin systems

由图5可知，未加保护剂的胰岛素冻干后效价降低了12%左右，这是由于胰岛素六聚体在冻干过程中，受温度和水分的影响，活性结构轻微发生了变化，从而引起效价降低。添加保护剂后，猪胰岛素的效价比明显提高。说明在冻干过程中，LEA-moitf对胰岛素有明显的保护效果。

3 结论

LEA-motif在干燥过程中能有效限制胰岛素的有害热运动，很好的保护其生物活性结构。LEA-motif保护的胰岛素氨基酸残基振动明显降低，刚性越强，说明氨基酸残基更加稳定，胰岛素结构在保护剂的作用下得到了很好的保持，胰岛素具有较高的稳定性。这主要是随着水分含量的减少，LEA-motif逐渐取代水分子胰岛素形成氢键，又因为静电相互作用的影响，LEA-motif形成适应胰岛素的形状，吸附在其表面，形成保护层，保护胰岛素的活性结构。LEA-motif保护的胰岛素六聚体冻干后活性更好。

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