蒲芍前列腺炎胶囊乙醇提取最佳工艺研究

董政起 赵海婷，2 王韫哲，2 崔佳音，2 仲崇林

1.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；3.吉林省中医药科学院，吉林长春 130021

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是中青年男性的常见病、多发病，该病症状复杂，病程较长，且容易复发，严重影响患者的身心健康[1-2]。蒲芍前列腺炎胶囊系在研的新药，是由土茯苓、蒲公英、牛膝、丹参、赤芍、红花等十味中药组成，具有清热利湿，活血通淋之功效，用于慢性前列腺炎（属于湿热下注证者）[3-4]。该制剂是治疗前列腺疾病的师传经验秘方，经30多年临床实践，吸收现代医学新成果，不断总结与改进，形成被临床许多病例验证取得满意疗效的复方制剂。

在蒲芍前列腺炎胶囊中，丹参、赤芍和红花需要乙醇提取脂溶性有效成分，且丹参及赤芍的用药量在本方中最大，是该药处方中的主药。为此需要对乙醇提取技术条件进行优选，以提高提取效率，最大程度获取丹参及赤芍的有效成分，发挥蒲芍前列腺炎胶囊的药效。在现有的研究中[5-6]，通常只对丹参或赤芍的乙醇提取工艺以各自的主要成分为指标进行单独考察，所优化的条件不能满足蒲芍前列腺炎胶囊的要求。因此，本研究采用正交设计试验法，以丹参酮ⅡA和芍药苷提得量为指标，综合考虑来选择蒲芍前列腺炎胶囊的最佳提取工艺[7-10]，为生产提供科学依据报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器

日本岛津LC-9A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器，N2010色谱数据工作站（浙江大学智能信息工程研究所），分析天平AL104（梅特勒托利多仪器有限公司）；回流提取装置（天津玻璃仪器厂）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

所用药材均购于安徽亳州药材市场；丹参酮ⅡA和芍药苷对照品由中国生物制品检定所提供，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 工艺条件的选择

本研究确定了影响提取效果的四个因素，即A：所用乙醇浓度；B：每次加乙醇量；C：每次提取时间；D：提取次数，并结合实际情况，本研究为每个因素确定了三个水平，见表1。笔者应用正交试验以丹参酮ⅡA提得量和芍药苷提得量为指标，按L9（3）4正交表进行试验。以处方量1/4为一份样品（赤芍30 g、丹参50 g、红花20 g），加乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇，浓缩液转移至100 mL的量瓶中，甲醇定容，分别测定丹参酮ⅡA和芍药苷含量。

表1 考察因素水平表

2.2 含量测定

2.2.1 丹参酮ⅡA含量测定方法

2.2.1.1 丹参酮ⅡA含量测定供试品液的制备 精密量取上述各浓缩液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.1.2 丹参酮ⅡA含量测定对照品溶液的制备 精密称取丹参酮ⅡA对照品5 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每1毫升中含丹参酮ⅡA 16.1 μg）。

2.2.1.3 丹参酮ⅡA含量测定方法学考察 ①色谱条件：用十八烷基硅烷键硅胶为填充剂，甲醇-水（73∶27）为流动相，检测波长为270 nm。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算，应不低于4000。②线性关系：分别精密吸取4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，注入高效液相色谱仪，按上述条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，丹参酮ⅡA的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=-797 026.50+46 075 057.45X，r=0.9997，线性范围：0.0644～0.322 μg。 ③精密度试验：分别配制高、中、低（6.44、0.322、0.0644 μg/mL）3 种浓度的丹参酮ⅡA 样品，按上述色谱条件分别于同一天内测定3次，连续测定3 d。日内精密度及日间精密度各组峰面积相对标准偏差（RSD）均小于2%。④重复性试验：取同一批次样品1 mL，共6份，按上述供试品溶液的制备及色谱条件测定，计算平均含量的RSD为1.9%。⑤加样回收率试验：精密称定已知含量的供试品6份，每份1 mL，置50 ml具塞棕色锥形瓶中，分别加入丹参酮ⅡA对照品溶液适量，按上述色谱条件分别测定，计算加样回收率。结果显示：6组样品的加样回收率分别为99.32%、100.42%、98.87%、99.63%、101.13%、97.88%，RSD均小于2%。⑥稳定性试验：取浓度为0.322 μg/mL的丹参酮ⅡA 样品室温放置 0、2、4、6、8、12 h，按上述条件进行测定，结果显示：丹参酮ⅡA浓度在12 h内浓度无明显变化，稳定性好，RSD小于2%。

2.2.1.4 丹参酮ⅡA样品含量测定 精密吸取供试品液、对照品溶液10 μL进样，注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算，即得。

2.2.2 芍药苷含量测定方法的建立

2.2.2.1 芍药苷含量测定供试品液制备 精密量取上述各浓缩液1.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2.2 芍药苷含量测定对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每毫升中含芍药苷0.193 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2.3 芍药苷含量测定方法学考察 ①色谱条件：用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；甲醇-水（35∶65）为流动相；检测波长为230 nm；流速1.0 mL/min。理论板数以芍药苷峰（C23H28O11）计算应不低于3000。②线性关系：分别精密吸取 2、4、6、8、10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，芍药苷的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程回 归 方 程 ：Y ＝ -35 241.360＋1 349 289.119X，r=0.9999，线性范围：0.386～1.930 μg。 ③精密度试验：分别配制高、中、低（38.6、1.93、0.386 μg/mL）3 种浓度的芍药苷样品，按上述色谱条件分别于同一天内测定3次，连续测定3 d。日内精密度及日间精密度各组峰面积相对标准偏差RSD均小于2%。④重复性试验：取同一批次样品1.5 mL，共6份，按上述供试品溶液的制备及色谱条件，测定，计算含量。结果显示，平均含量的RSD为1.1%。⑤加样回收率试验：精密称定已知含量的供试品6份，每份 1.5 mL，置50 mL具塞锥形瓶中，分别加入芍药苷对照品溶液适量，按上述色谱条件分别测定，计算加样回收率。结果显示：6组样品的加样回收率分别为98.82%、97.45%、100.87%、100.15%、98.35%和99.92%，RSD均小于2%。⑥稳定性试验：取浓度为1.93 μg/mL的芍药苷样品室温放置 0、2、4、6、8 和 12 h，按上述条件进行测定，结果显示：芍药苷浓度在12 h内浓度无明显变化，稳定性好，RSD小于1%。

2.2.2.4 芍药苷样品含量测定 精密吸取供试品液、对照品溶液10 μL进样，注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算，即得。

2.3 方差分析结果

方差分析结果表明：影响丹参酮ⅡA得量的主要因素依次为 B（乙醇用量）、A（乙醇浓度）、D（提取次数）、C（提取时间）；影响芍药苷得量的主要因素依次为 D（提取次数）、A（乙醇浓度）、B（乙醇用量）、C（提取时间）。综合上述两项试验结果并考虑生产成本因素，确定为A1B1C3D1，即80%乙醇加热回流提取3次，每次1.0 h，每次加醇量分别为6倍，此为蒲芍前列腺炎胶囊的最佳乙醇提取工艺。丹参酮ⅡA和芍药苷含量及方差分析结果见表2～5。

表2 正交试验表及试验结果（以丹参酮ⅡA为指标）

表3 方差分析

表4 正交试验结果（以芍药苷为指标）

表5 方差分析

3 讨论

蒲芍前列腺炎胶囊主要由活血化瘀药味组成，已有研究报道丹参、赤芍、红花有改善微循环、减轻炎性反应、抑制结缔组织增生作用，同时也有免疫调节作用[11]。此外，丹参酮ⅡA和芍药苷作为单体化合物，也被证明具有抑制炎性免疫反应作用，可抑制淋巴细胞和单核细胞释放类似的生长因子，从而减少了层粘连蛋白合成，促使前列腺炎症减轻，纤维化程度减弱[12-13]。因此笔者选择丹参酮ⅡA和芍药苷为乙醇提取工艺优化的指标性成分是有一定科学依据的。丹参酮ⅡA和芍药苷不但是本方中君药的主要成分，也是本方发挥药理作用的关键有效成分。

丹参酮ⅡA、芍药苷的含量测定方法，本研究在参照《中国药典》2010年版[9]规定及相关文献[14-15]的基础上，优化出符合本提取工艺的高效液相色谱条件。该方法简便、准确、专属性强，也可用于该制剂的质量控制。

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