高血压大鼠穹窿下器神经元型一氧化氮合酶阳性神经元的表达及意义

郭建美

穹窿下器(subfornical organ，SFO)是感受性室周器官之一，缺乏血脑屏障，研究证实其与饮水、血压等多方面的调节有关［1］。穹窿下器内含有一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，NOS)阳性神经元，而一氧化氮是血压调节的重要信息分子之一，其在神经系统中含量丰富，且与高血压的发生密切相关［2］。有研究显示，NO缺乏可能是高血压发生的原因之一［3］。本文用ABC免疫细胞化学方法，观察高血压大鼠SFO内神经元型NOS(nNOS)阳性神经元的变化，探讨SFO内nNOS免疫阳性神经元在高血压形成和发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 选择雌性Wistar大鼠(清洁级，体重230～250 g，由河北医科大学动物中心提供)40只，随机分为2组，实验组(n=30)和对照组(n=10)。实验组予以左旋硝基精氨酸(L-NNA)15 mg·d-1·kg-1，分别于上午 8∶00、下午 8∶00 两次腹腔注射，制备高血压动物模型。实验组根据动物血压及腹腔注射时间分为3组:用药2周组、用药4周组和用药8周组，每组10只。对照组不做任何处理。

1.2 动物血压的测量［4］应用大鼠生理记录仪采用尾部套囊的方法测量收缩期血压。测定条件:环境安静，温度30℃，测量前将大鼠放入暖箱中使其身体暖和并适应其环境15～30 min，到时间后将大鼠取出放入鼠袋中留出全部鼠尾，并放入仪器中固定位置，在尾根部套入环式气囊，进行血压测定并读取数据。必须在大鼠安静状态下测定3次，取其平均值。适应性喂养期间每隔1 d测血压1次，主要目的是使大鼠适应实验环境。分组后每周测血压1次。

1.3 高血压的评判标准 目前国际上还没有大鼠动态血压正常值及高血压的统一标准，根据美国和欧洲最新公布的高血压治疗新指南［5］(JNC-T指南和ESH/ESC指南)及张维忠等［6］建议的动态血压暂时参考标准，本研究规定大鼠动态血压的收缩压/舒张压符合白昼 ＞150/100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，夜间 ＞140/90 mm Hg时为高血压。

1.4 光镜样品制备 实验动物给予10%水合氯醛按0.3 ml/100 g体重麻醉后，经左心室灌注37℃预热的0.9%氯化钠溶液200～250 ml，后灌注4℃ 4%多聚甲醛150 ml(先快后慢，25 min内灌注完毕)，取脑后立刻将脑组织放入4%多聚甲醛4℃后固定，8 h后将脑组织分别沿视交叉前方和垂体根部后方冠状位切开，取SFO相应脑区3～4 cm厚度组织，放入4%多聚甲醛中继续后固定12 h。后固定结束后选取包含有穹窿下器的脑块，常规石蜡包埋，连续石蜡切片，片厚5μm，nNOS免疫组织化学显色、封片。显微镜观察、摄片。

1.5 免疫细胞化学染色方法 取上述HE染色的相邻切片:(1)常规脱蜡，经各级乙醇至水。(2)0.01 mol/L pH=7.4 PBS浸泡5 min。(3)封闭内源性过氧化物酶:切片入10%H2O2/甲醇室温下浸泡15 min。(4)抗原修复:将切片浸入枸橼酸缓冲液，在免疫组化专用微波炉中进行微波修复20 min，室温下自然冷却。(5)封闭非特异抗原:10%山羊血清封闭，室温下30 min。(6)加入一抗:4℃冰箱孵育过夜，以不加一抗而用PBS缓冲液代替的切片同时染色，做阴性对照。(7)加入二抗:生物素化羊抗兔IgG，37℃下孵育30 min。(8)加入三抗:，加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物，即SABC，37℃下孵育20 min。(9)DAB室温下显色5～10 min，待显色完全后自来水终止显色。(10)常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Olympus万能照相机观察照像。

1.6 图像分析 选取10×40倍视野调整好显微镜的光源强度使之保持不变，对穹窿下器进行扫描。扫描过程中保持4个固定，即:(1)显微镜的光源强度固定;(2)曝光数固定;(3)白平衡值固定;(4)视场域大小固定。每只大鼠具有以上部位的切片各选5张，每张切片选以上部位结构清楚的5个阳性细胞进行画分割，然后选取平均灰度值这个参数进行测量，计算机直接得到这项指标的平均值。平均灰度值反应组织、细胞的明暗，间接反应所含化学物质的多少，数值越大表明含量越少。

1.7 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，应用SNK-q检验分析，进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 L-NNA的升压效应 尾压测量L-NNA给药前对照组和模型组的收缩压差异无统计学意义(P＞0.05)。L-NNA用药2、4、8周，模型组的收缩压均明显高于对照组(P＜0.05)。L-NNA用药2周后，模型组形成了高血压(159.6 mm Hg＞150.0 mm Hg)。此后，血压继续升高，到用药4周时，血压升至(171±8)mm Hg，此后，血压升高缓慢，稳定在此水平。见表1。

表1 给L-NNA后血压随时间的变化n=10，mm Hg，±s

表1 给L-NNA后血压随时间的变化n=10，mm Hg，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别 2周 4周 8周112±8 109±7 111±7模型组 160±8* 171±8* 173±8对照组*

2.2 镜下观察结果 对照组:在冠状切片上可见nNOS免疫阳性细胞排列密集，单个细胞形态较清晰，均匀分布于整个SFO内，阳性细胞呈棕黄色，位于胞质，胞核不着色，细胞胞体中等大小，呈圆形或椭圆形，突起较短或不明显，灰度值测定为(179.24±9.62)。模型组:用药2周组阳性细胞在SFO背侧部及两背侧边缘带的大血管周围分布较密集，细胞呈棕褐色，胞体中等大小，形态多样，呈圆形、梭型或三角形，有些可见由胞体发出的短突起灰度值测定为(159.32±7.22)。用药4周组阳性细胞着色变浅，呈棕黄色。胞体呈圆形或椭圆形，未见明显突起灰度值测定为(192.48±6.02)。用药8周组阳性细胞呈淡黄色。胞体呈球形，未见明显突起灰度值测定为(191.78±5.84)。见图1～4，表2。

图1 对照组(HE×400)

图2 用药2周组(HE×400)

图3 用药4周组(HE×400)

图4 用药8周组(HE×400)

表2 不同组别nNOS阴性细胞的变化±s

表2 不同组别nNOS阴性细胞的变化±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与用药2周比较，#P＜0.05

组别 2周 4周 8周179±10 179±10 179±10模型组 159±7* 192±6*# 192±6*#对照组

3 讨论

高血压是常见病和多发病，可引起心、脑、肾等靶器官的损害。高血压的发生和体内NO的减少有关。本实验参考近年来有关方法［7］用一氧化氮合酶抑制剂—L-NNA腹腔注射大鼠来复制NO缺乏型高血压大鼠模型。腹腔注射L-NNA后3 d，大鼠出现反应迟钝、顺从、反抗能力减低、摄食、饮水较正常组为多等临床症状。L-NNA给药2周后血压升至159.6 mm Hg，符合高血压的诊断标准。提示此种方法造模成功。在造的45只动物模型中，有3只不明原因死亡，其余42只全部达到高血压标准，造模成功率达90%以上。

SFO位于第三脑室前背侧壁、海马连合腹侧穹窿脚分歧处，恰在两个侧脑室与第三脑室顶之间，在垂直轴上或矢状切面上，恰好平对室间孔平面，属于感受性室周器官(sensory circumventricular organs，SCVOs)［1］。多年来人们对其形态结构己有了较深的认识，有研究认为，感受性室周器官即可能作为脑的开窗来感受外周血携信息的变化［1］。SFO缺乏血脑屏障，与其他部位相比可能会更早的接触血携信息，而提前发生改变。Gaillard等［8］研究证实，腹腔注射内毒素(LPS)主要经室周器官等缺乏血脑屏障的位点、血脑屏障位点及某些传入性神经纤维(如迷走神经)入脑。朱望东等［9］研究发现，在应用不同剂量的LPS后，SFO部位较早出现一氧化氮合酶(nitri coxide synthas，NOS)蛋白表达;Quan等［10］曾观察了在外周给予内毒素后，IL-10 mRNA表达的时程变化，发现SFO处为最早表达的部位之一，并从SFO处起始逐渐向脑内表达到高峰。

nNOS免疫组化结果显示，在用药2周组，穹窿下器内nNOS免疫阳性细胞灰度值较正常组降低，此种现象未见相关报道。在用药4周组，穹窿下器内nNOS免疫阳性细胞灰度值较正常组增加，这与李红等［11］的报道一致。在用药8周组，nNOS免疫阳性细胞灰度值和用药4周组相似。灰度值反应组织、细胞的明暗，间接反应所含化学物质的多少，数值越大表明含量越少。在本研究中随着用药时间的延长，在SFO的nNOS免疫阳性细胞染色呈现先增加后减低的规律。这提示在用药初期，NO水平降低，被SFO感知后产生相关反应，分泌对nNOS敏感的相关物质，从而表现为高表达。而随着时间的延长，大鼠体内的NO水平最终下降并达到另一个新的水平，SFO不再能感知到NO的水平波动，故而nNOS相关物质的分泌减少，故转为低表达。通过本研究发现SFO在体内NO水平波动时在形态学方面发生了明显的变化，其具体机制还有待进一步的研究。

1 Johnson AK，Gross PM.Sensory circumventricular organs and brain homeostatic pathways.J-FASEB，1993，7:678-686.

2 周初松，靳安民，马大烈.大鼠脊髓组织一氧化氮合酶显微及超微结构特征.第一军医大学学报，2000，20:485-487.

3 郭志刚，沈建刚，翁昌鸿，等.冠心病、高血压病人血浆氧自由基、一氧化氮及纤溶性的变化.第一军医大学学报，1999，19:124-126.

4 邓江，吴芹，黄燮南.经大鼠尾动脉无创性血压测量的方法.遵义医学院学报，2008，31:184-186.

5 张维忠.美国和欧洲高血压治疗新指南评析.中华心血管病杂志，2003，31:650-652.

6 张维忠，施海明，王瑞冬等.动态血压参数正常参照值协作研究.中华心血管病杂志，1995，10:325-328.

7 Charpie JR，Charpie PM，Goud C，et al.Quinapri Preventshypertension andenhanced vascular veactivity innitroarginine treaterats.Blood Pressure，1997，6:117-124.

8 Gaillard RC.Interaction between the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the immunolo gicalsystem.Neurosci，2001，24:320-324.

9 朱望东，马常升，曹翠丽，等.不同免疫状态下穹窿下器的一氧化氮合酶细胞的变化.解剖学杂志，2001，24:132-135.

10 Quan N，Whiteside M，Herkenham M.Time course and localization patterns of interleukin-1 messengeger RNA expression in brain and pituitary after peripheral administrationof lipopolysaccharide.Neuroscience，1998 Mar，83:281-293.

11 李红，徐健，徐鹏宵.自发性高血压大鼠室周灰质中NOS阳性神经元的形态学观察.武警医学院学报，2007，16:114-116.