氢气饱和等渗盐水腹腔注射治疗兔创伤性关节炎的实验研究

马广斌，黄永吉，严冬雪

0 引 言

随着社会的发展和人们生活节奏的加快，创伤性关节炎(traumatic arthritis，TA)的发病率呈明显的上升趋势。TA又称外伤性关节炎或损伤性骨关节病。以关节疼痛活动障碍为主要临床表现。目前临床上对于早期TA的诊断缺乏明确的指标，后期的治疗又缺乏特异性药物，大量患者在疾病发展的后期严重影响生活质量，重者甚至导致残疾。对于TA的诊断和治疗已普遍引起医学界的关注。近年来的研究对其发病机制有了更进一步的认识，认为TA病理演化的一个重要环节即为炎症。

Charib等［1］首次证明氢气具有抗炎作用。Ohsawa等［2］报道动物呼吸2%的氢气就可以有效清除自由基，改善脑缺血再灌注损伤。近年来，大量的研究表明，作为一种选择性抗氧化物质，氢气具有抗氧化、抗炎症等作用，并对多种疾病治疗效果显著［3-5］。本研究旨在探讨氢气对TA的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 8～12月龄普通级雌性新西兰家兔26只，体重2.0～2.5 kg，购自广西医科大学动物实验中心(合格证号:SCXK桂2003-0003)，普通级饲养环境，室内保持12 h光照、12 h避光的循环饲养，控制室温为(22±1)℃、相对湿度50%～60%。所有动物按标准动物饲料分笼喂养，自由饮水。采用随机数字表法将26只家兔分为模型实验组10只、模型对照组10只和正常对照组6只。

1.2 TA模型的建立 模型组20只家兔10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。按Han等［6］提供的方法选择家兔右侧膝关节，严格术区消毒及术中无菌操作行右膝半月板切除术，术后缝合皮肤无菌纱布包扎伤口;正常对照组行假手术，手术当天给予青霉素肌内注射抗炎治疗，以防止术口感染，连用1周。

1.3 模型建立成功的判断标准 手术后13周时对TA模型进行评价。①行为改变标准:出现疼痛行为，触摸右膝关节时出现弹腿挣扎。平地驱赶行走时右后肢跛行;②影像学评价:将造模家兔右后肢行X线检查，X线下见不同程度的骨赘形成，软骨下骨硬化，骨质疏松，但关节间隙还未出现明显狭窄(符合此改变者说明造模成功);③膝关节肿胀积分法［7］:0=无;1=可触及肿胀;2=可视下肿胀。

1.4 治疗药物及给药途径

1.4.1 药物 氢气由桂林医学院科学实验中心提供，氢气饱和等渗盐水的制备按照文献［8］的方法进行。

1.4.2 给药方法 动物模型第13周开始给药，模型实验组予以8 mL/kg氢气饱和等渗盐水腹腔注射，模型对照组予以等量等渗盐水腹腔注射，每3天注射1次，持续6周，正常对照组不做任何处理，其余条件相同。

1.5 检测指标 ①行为改变标准:0=明显改善(即触摸右膝关节时弹腿挣扎不明显。平地驱赶行走时右后肢跛行较轻)，1=改善不明显(即触摸右膝关节时弹腿挣扎明显。平地驱赶行走时右后肢跛行明显)。②膝关节肿胀评分。③血清与关节液中HA的含量:在腹腔注射前及治疗结束后各组均采取耳缘静脉血3 mL，立即分离血清，检测HA，同上述2个时间段用注射用水2 mL冲洗关节腔，取冲洗液离心，取上清液测定关节液中HA含量。④同上述中的时间及方法各取家兔静脉血及关节液测定NO含量，NO测定用硝酸还原酶法，试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供，具体方法参照试剂盒说明书。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法进行检验比较;多样本率或构成比的比较用卡方检验，同一受试对象在接受处理前后的比较采用配对t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 26只家兔均健康存活，无一例死亡;体重增加8%～46%，平均21%，无一例体重下降;正常对照组无一例出现疼痛行为的改变。

2.2 氢气饱和等渗盐水对TA的影响

2.2.1 各组动物行为学改变情况 氢气饱和等渗盐水组10只家兔治疗后有8只改善明显，剩余2只无明显变化。模型实验组有3只行为活动有改善，剩余7只变化不明显。提示氢气饱和等渗盐水对改善TA症状有明显效果。

2.2.2 各组动物关节肿胀变化的比较 造模成功后，第13及19周分别对模型组的20只动物进行右膝关节外观检查。13周时模型组20只家兔右膝关节均出现不同程度的肿胀，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);19周治疗结束时，模型实验组关节肿胀明显减轻，与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05)，模型对照组治疗前后差异无统计学意义(P＞0.05)，关节肿胀无明显减轻，正常组前后无特殊变化。见表1。

表1 治疗前后各组家兔右膝关节肿胀评分变化比较(n)Table 1 Comparison of knee swelling scores between the two groups pre-and post-treatment(n)

2.2.3 各组动物治疗前后关节液及血清中NO含量 治疗前模型组动物血清中NO含量有升高的趋势(P＜0.05)，关节液中 NO含量明显升高(P＜0.01)。治疗后模型实验组血清及关节液中NO的含量均下降(P＜0.05)，尤以关节液中下降更明显(P＜0.01)。模型对照组无明显变化(P ＞0.05)。见表2。

表2 治疗前后各组家兔血清及关节液中NO的含量变化(±s)Table 2 Changes of NO content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

表2 治疗前后各组家兔血清及关节液中NO的含量变化(±s)Table 2 Changes of NO content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;与治疗前比较，#P ＜0.05、##P ＜0.01

组别 n 治疗前 治疗后血清 关节液正常对照组 6 75.18±14.80 70.26±10.53血清 关节液——模型实验组 10 79.58±13.46* 89.45±14.98＊＊76.23±12.15#80.36±12.78##模型对照组 10 78.22±13.96 89.78±14.11 77.13±12.85 87.21±15.36

2.2.4 各组动物治疗前后血清及关节液中HA的含量 治疗前模型组血清中HA的含量明显高于正常对照组(P＜0.05)，关节液中HA含量明显低于正常组(P＜0.05)。治疗后模型实验组血清中HA含量明显下降(P＜0.05)，关节液中HA的含量上升(P＜0.05)，模型对照组治疗前后变化不明显(P ＞0.05)。见表3。

表3 各组家兔治疗前后血清及关节液中HA含量变化(±s)Table 3 Changes of HA content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

表3 各组家兔治疗前后血清及关节液中HA含量变化(±s)Table 3 Changes of HA content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

与正常对照组比较，*P ＜0.05;与治疗前比较，#P ＜0.05

组别 n 治疗前 治疗后血清 关节液正常对照组 6 338.26±41.27 2.41±0.41血清 关节液——模型实验组 10 436.82±60.91* 1.72±0.37* 340.21±40.57# 2.47±0.62#模型对照组 10 430.96±58.72 1.84±0.42 432.12±47.27 1.72±0.37

从以上各项观测指标可分析得出，模型实验组经过氢气饱和等渗盐水腹腔注射后在行为学、组织因子及自由基变化上表现为治疗前后有明显差异。可以认为氢气饱和等渗盐水腹腔注射可能对TA的治疗可能有一定效果。

3 讨 论

3.1 氢气在疾病治疗方面的新认识 Buchholz等［9］首次证明了呼吸氢气能保护小肠移植后的损伤，首次检测了炎症因子在实验中的变化，并依此提出了氢气具有抗炎症的作用。国外也有文献报道过氢气在治疗类风湿性关节炎方面取得了一定疗效，治疗手段为让患者每天饮用高浓度氢气水530 mL［10］。用血液和尿液中8羟基鸟嘌呤作为氧化损伤的指标，用C反应蛋白作为炎症反应的指标。结果发现，尿液氧化指标和炎症反应指标均显著下降，5名早期患者全部都明显缓解，其中4名患者在整个治疗结束后症状完全消失。该研究说明，作为一种抗氧化物质，氢气具有治疗类风湿关节炎的作用。Chen等［11］的研究表明氢气在治疗脊髓损伤方面有一定的效果，这是所见报道中首次涉及氢气治疗创伤性疾病的研究，同时也为本实验的开展引领了方向，是本组实验研究的目的之所在。

3.2 氢气治疗TA机制的探讨 TA主要是负重关节损伤后引起的一种后遗症，是由于连续的物理性或机械性损伤导致的可运动关节的软骨变性破坏，以及在此基础上的关节软骨、软骨下软骨、滑膜、关节囊及周围的肌肉组织和韧带的一系列改变而引起的关节疼痛、功能障碍［12］。国内许鹏等［13］研究证实TA发病机制过程中有自身免疫反应发生，并在实验中证实这一结论。在测定TA血清和关节液中自由基的含量时发现此类患者关节液中存在较高水平自由基，结合已被学者所共识的NO在各种自身免疫性关节炎中的重要作用，故认为NO和自由基在TA的发病中具有重要的作用。这也是本实验评价TA动物模型治疗效果的主要指标。

TA发生发展的主要因素是关节软骨细胞与软骨基质之间的失衡。软骨细胞负责合成基质，基质为细胞提供力学支持，两者之间的稳定决定了关节软骨的稳定性［14］。而两者关系遭受破坏的具体机制仍有待进一步研究。透明质酸是软骨基质糖胺多糖的主要组成成分，在滑膜关节中。HA在软骨和关节液中起主要润滑作用，关节损伤以后HA在血清和关节液中的含量及分子量均会有相应的变化，这成为本实验的又一检测指标［15-16］。

多项研究表明，氢气具有选择性抗氧化作用，能自由穿过细胞膜结构，分布于细胞液、线粒体内，可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，而后两者是氧化损伤的最重要的介质［17-18］。从这一角度不难看出，以氧化应激为发病机制的多种疾病、炎症、慢性疼痛以及缺血均成为了氢气治疗的研究方向。本组实验同样取得了比较理想的效果。对于NO等含量的变化符合炎症转归的变化，我们初步认为氢气在治疗TA中的治疗机制同样是选择性抗氧化作用。

3.3 氢气治疗TA的前景展望 由于缺乏特异性的指标与早期临床表现，TA的早期或中期诊断往往较为困难。对于TA的治疗目前仍缺乏特异性药物。一般疗法及温热疗法、针灸、推拿、微波红外等物理疗法只能延缓或阻止早期病程的进一步发展，但效果的可靠性因人而异。对于药物疗法，目前临床应用较多的包括非甾体抗炎药、昔布类药物、软骨保护药物及中草药。最为传统的非甾体抗炎药也有着肾损伤、软骨损害、消化道损伤等副作用。外科手术因对早起患者适应证较窄、创伤较大而受到限制，只能为部分生活质量严重下降，有致残可能的晚期患者所接受。基因治疗是一种新兴的治疗手段，其疗效和临床应用还有待于进一步发展［15］。目前的研究认为选择性抗氧化作用使得氢气在体内的“选择”较少，参与的机体反应相对较少，未见对机体有副作用，而且价格低廉，能为广大患者所接受。目前研究的氢气水、氢气饱和等渗盐水可通过直接饮用、局部注射、静脉注射等途径给药，如果大量的研究证实氢气治疗TA的疗效，将为广大患者带来新的希望。

关于氢气在治疗TA中的作用机制，还只是处于初步探讨的阶段，仍有待于进一步研究。作为一个新兴的领域，由于研究的深度和广度有限，目前尚难以进行全面清晰的描述。目前大量实验仅局限于在动物模型上进行，其对人体疾病的作用及是否具有目前尚未检测出的毒副作用，需更为长期研究加以证实。氢气是否就是一种理想的选择性抗氧化物质，其选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子的机制目前也存在争议［19］，但在动物模型身上证明了其治疗疾病的有效性，这为进一步深入研究奠定了基础。

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