HPLC测定灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸和木犀草苷的含量△

吴飞燕，卿志星，曾建国，2*

(1.湖南中医药大学 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410208； 2.湖南农业大学 兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程 研究中心，湖南 长沙 410128)

研究开发

HPLC测定灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸和木犀草苷的含量△

吴飞燕1，卿志星1，曾建国1，2*

(1.湖南中医药大学 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410208； 2.湖南农业大学 兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程 研究中心，湖南 长沙 410128)

目的：利用HPLC测定灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸和木犀草苷的含量。方法：采用Agilent ZORBAX SB-phenyl C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%醋酸水溶液进行等度洗脱，检测波长为350 nm，流速为1 mL·min-1，柱温为25 ℃。结果：灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸的含量为花>叶>枝；木犀草苷的含量为叶>花>枝。结论：本法简便、灵敏、重复性好，可用于灰毡毛忍冬不同部位样品中绿原酸和木犀草苷的含量测定。

灰毡毛忍冬；绿原酸；木犀草苷；高效液相色谱；含量测定

山银花为传统中药材，具有清热解毒，疏散风热的功能。《中国药典》2000年版及之前版本将山银花作为金银花收载，《中国药典》2005年版之后将这两个品种分开收载：山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、华南忍冬LoniceramacranthoidesDC.或黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]。2005版之前的《中国药典》将绿原酸作为山银花与金银花的标示成分，而2005版之后的《中国药典》将木犀草苷作为金银花的另一标示成分，将灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为山银花的标示成分。但据报道，目前山银花中有许多新的改良变种，其木犀草苷的含量甚至超过了金银花[2-3]，所以，以木犀草苷为特征成分已不能很好地区分金银花和山银花。山银花在种植栽培过程中为了增产，需要在冬季和早春进行枝叶修整，这些枝叶产量较大，但长期以来都作为非药用部分而未得到利用。灰毡毛忍冬是山银花中栽培面积最广的品种，在湖南、四川等地均有大量栽培，全国种植面积有6万公顷左右，为西南地区银花药材主流商品之一[4]。课题组前期实验发现，灰毡毛忍冬枝叶中木犀草苷含量较高，为了合 理利用中药资源，该实验采用HPLC同时测定灰毡毛忍冬不同部位(枝、叶、花)绿原酸和木犀草苷的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Series高效液相色谱仪(G1311C二元高压梯度泵，G1329B在线脱气机，G1315D二极管阵列检测器，Rev.B.04.03色谱工作站，美国Agilent)；AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ5200DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；DHG-9246A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；冷冻离心机(HERMLE 2323K，德国)；FW100型高速万能粉碎机(天津市太斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

绿原酸对照品(批号：110753-201314，纯度：98%)、木犀草苷对照品(批号：111720-201106，纯度：99.3%)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、乙醇均为色谱纯，醋酸为分析纯，水为Mili-Q超纯水。

灰毡毛忍冬分别采自湖南辰溪、湖南麻阳、湖南隆回、重庆秀山，经湖南中医药大学杨广明教授鉴定为灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.的花、枝、叶。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称定绿原酸对照品27.0 mg于25 mL量瓶中，并用50%甲醇溶液溶解并定容，配制成浓度为1.08 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液；精密称定木犀草苷对照品10.3 mg于25 mL量瓶中，并用70%乙醇溶液溶解并定容，配制成浓度为0.412 mg·mL-1的木犀草苷对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

将灰毡毛忍冬样品(枝、叶、花)杀青烘干(薄摊于烘箱内，先于105 ℃条件下烘干5 min，再以60 ℃条件下烘烤至干)，粉碎过四号筛，取粉末2 g于100 mL具塞锥形瓶中，加70%甲醇50 mL密封，超声提取(250 W，频率35 kHz)60 min，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)和0.5%醋酸溶液(B)进行等度洗脱(0～15 min：20%A)，流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；进样量：10 μL。色谱图见图1。

A.混合对照品 B.灰毡毛忍冬叶(麻阳) 1.绿原酸 2.木犀草苷图1 灰毡毛忍冬及对照品HPLC图

2.4 线性范围考察

分别精密吸取系列质量浓度的对照品溶液10 μL，按2.3色谱条件进样分析，以绿原酸、木犀草苷的峰面积为纵坐标(Y)，以质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得线性回归方程。绿原酸线性方程：Y=29 960X+14.382，r=0.999 8，结果表明绿原酸质量浓度在0.002～0.295 6 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系；木犀草苷线性方程：Y=29 067X-15.144，r=0.999 6，结果表明木犀草苷质量浓度在0.001～0.099 3 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取绿原酸和木犀草苷对照品溶液各10 μL进样，平行进样7次，记录峰面积积分值，结果绿原酸和木犀草苷峰面积积分值的RSD分别为0.25%，0.11%。

2.6 稳定性试验

精密称取同一批灰毡毛忍冬叶(辰溪)粉末2 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，于0，2，4，6，8，10，12 h分别进样10 μL，测得绿原酸和木犀草苷峰面积积分值的RSD分别为0.42%，0.46%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批灰毡毛忍冬叶(辰溪)粉末5份，每份约2 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，计算绿原酸和木犀草苷的平均质量分数分别为2.080%，0.338%，结果绿原酸和木犀草苷质量分数的RSD分别为1.45%，1.84%。

2.8 加样回收率试验

精密称取同一批灰毡毛忍冬叶(辰溪)粉末6份，每份约0.5 g，分别精密加入绿原酸对照品溶液(1.08 mg·mL-1)10 mL和木犀草苷对照品溶液(0.42 mg·mL-1)4 mL。按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL进行分析，结果见表1、2。

2.9 样品测定

采集辰溪、麻阳、隆回、秀山4个产地的灰毡毛忍冬，分别取枝、叶、花3个不同的部位。按2.2项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，分别计算不同产地灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸和木犀草苷质量分数，结果见表3。

表1 灰毡毛忍冬中绿原酸加样回收试验

注：绿原酸对照品加入量均为10.80 mg

表2 灰毡毛忍冬中木犀草苷加样回收试验

注：木犀草苷对照品加入量均为1.68 mg

表3 灰毡毛忍冬中绿原酸和木犀草苷的测定 /%

3 讨论

山银花中主要的抑菌成分是绿原酸。现行《中国药典》是以木犀草苷为特征成分区分金银花和山银花，所以本实验对灰毡毛忍冬不同部位的绿原酸和木犀草苷同时进行含量测定。实验结果表明，灰毡毛忍冬不同部位中绿原酸的含量为花>叶>枝，与赵成[5]得到的绿原酸含量测定结果(花>叶>茎)类似；灰毡毛忍冬花和叶的平均含量都大于2.5%，高于《中国药典》山银花项下绿原酸的限度要求(2.0%)；灰毡毛忍冬不同部位中木犀草苷的含量为叶>花>枝，有些产地的花中木犀草苷含量已经达到《中国药典》对金银花的限度要求(0.05%)，王艳艳等[2]对不同产地的灰毡毛忍冬进行了木犀草苷的含量测定，其中有很多地区的含量也都超过了《中国药典》的含量限度要求。所以，将木犀草苷作为金银花的特征成分有待商榷。对于药理作用方面，王林青等[6-7]用金银花和山银花进行体外抗伪狂犬病病毒(PRV)和新城疫病毒(NDV)试验，发现两者之间的抗病毒效果差异不显著。因此，笔者建议，《中国药典》将山银花和金银花分列为两个品种应该进行进一步的实验。

实验结果显示，灰毡毛忍冬的枝和叶均含有绿原酸和木犀草苷，其中叶中的绿原酸含量为花的40%左右，且叶中木犀草苷含量(0.294%)远大于花(0.051 0%)。目前，已有相关文献报道山银花茎叶含有绿原酸，耿世磊等[8]利用荧光显微镜观察到山银花茎、叶及花中均分布有绿原酸。赵成[5]对山银花不同器官进行了体外抗菌试验，抑菌效果为叶>花蕾>茎>根。刘敏等[9]探讨灰毡毛忍冬茎叶不同极性成分的体外抗氧化能力，结果表明，正丁醇提取物对DPPH自由基清除作用最强，推测其作用成分主要是绿原酸。 但目前还尚未见灰毡毛忍冬枝和叶中木犀草苷的相关药理作用研究，本文可为此类研究提供相关参考。就实验结果和文献报道证明，灰毡毛忍冬的枝和叶具有一定的利用价值，民间目前也有将灰毡毛忍冬枝叶用于添加到猪饲料的习惯，灰毡毛忍冬种植过程中每年要进行多次枝叶修整，产量较大，可考虑将其利用到兽药领域，比如加大灰毡毛忍冬枝叶用量来代替山银花的花作为动物用药，这样不仅可以避免动物与人争夺药源，还可以综合利用资源，提高农户的经济收入。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：28-29，205-206.

[2] 王艳艳，徐晓玉，邓君，等.HPLC法同时测定灰毡毛忍冬中绿原酸与木犀草苷的含量[J].中药材，2009，32(11)：1705-1707.

[3] 李锦燊，吴洪文.HPLC同时测定山银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J].北方药学，2013，10(8)：10-11.

[4] 许小方，李会军，李萍，等.灰毡毛忍冬花蕾中的化学成分[J].中国天然药物，2006，4(1)：45.

[5] 赵成.山银花不同器官的绿原酸含量及体外抑菌效果比较[J].安徽医药，2006，10(8)：584.

[6] 王林青，崔保安，张红英.金银花、山银花黄酮类提取物体外伪狂犬病病毒作用研究[J].中国畜牧兽医，2011，38(3)：183-187.

[7] 王林青，崔保安，张红英，等.金银花、山银花绿原酸类提取物体外抗NDV作用研究[J].中国农学通报，2011，27(19)：277-282.

[8] 耿世磊，徐鸿华，赵晟，等.山银花茎、叶、花中绿原酸分布规律研究[J].中草药，2004，35(3)：316-317.

[9] 刘敏，管福琴，王海婷.灰毡毛忍冬茎叶不同极性成分的体外抗氧化活性研究[J].食品科学，2012，37(4)：211-214.

HPLCDeterminationofChlorogenicAcidandGaluteolininDifferentPartsofLoniceramacranthoides

WU Feiyan1，QING Zhixing2，ZENG Jianguo1，2*

(1.HunanCo-InnovationCenterforUtilizationofBotanicalsFunctionalIngredients,HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalmedicineresourcesandinitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

Objective：To quantify chlorogenic acid and galuteolin in different parts ofLoniceramacranthoidesby HPLC method.Methods：The analysis was performed on Agilent ZORBAX SB-phenyl C18column (250mm×4.6mm，5μm).The mobile phase composed of acetonitrile-0.5% acetic acid aq.with isocratic elution.The detecting wavelength was350nm.The flow rate was1mL·min-1and the column temperature was25℃.Results：The chlorogenic acid content in different parts ofL.macranthoidesis flowers>leaves>branches.The galuteolin content is leaves>flowers>branches.Conclusion：The method is simple，sensitive and repeatability，which can be used for determining the content of chlorogenic acid and galuteolin in different parts ofL.macranthoides.

Loniceramacranthoides；Chlorogenic acid；Galuteolin；HPLC；Content determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.003

2014-02-20)

农业行业标准制定与修订(兽药)(112203)，国家科技支撑计划(2012BAI29B04)

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曾建国，教授，博士生导师，研究方向：中药资源与中兽药开发；Tel：(0731)84635293，E-mail：ginkgo@world-way.net