大鼠心室肌细胞急性酶分离及瞬时外向钾电流的记录

张良胜等

[摘要] 目的 探索成年SD大鼠心室肌细胞急性酶分离及记录瞬时外向钾电流的方法。 方法 以成年SD大鼠为研究对象，利用Langendorff灌流系统，利用Ⅱ型胶原酶二步灌流方法分离细胞，利用膜片钳技术记录大鼠心室肌瞬时外向钾电流。 结果 镜下可见存活心肌：呈杆状或矩形，表面干净，横纹清晰，立体感强，能记录出瞬时外向钾电流达3000 pA。 结论 本实验所用的方法细胞成活率高，能记录出瞬时外向钾电流。

[关键词] 心肌细胞；瞬时外向钾电流；膜片钳技术

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（a）-0020-03

Separation of acute enzyme of ventricular myocyte and record of transient outward potassium current in rats

ZHANG Liang-sheng1 LI Ping1 XU Xiang1 WANG Li1 FAN Zhong-cai2

1.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongzhou City in Henan Privince，Yongzhou 476600，China；2.Department of Cardiology，Affliated Hospital of Luzhou Medical College， Luzhou 646000，China

[Abstract] Objective To explore the method of acute isolate of separation of acute enzyme of ventricular myocyte and recording transient outward potassium current in adult SD rats. Methods Adult SD rats were selected as subjects， Langendorff perfusion system and type Ⅱ collagenase two step perfusion method were used to separate cell， and pacth clamp technique was used to record transient outward potassium current of ventricular myocyte in rats. Results The viable myocardium was seen Microscopically：it is lod or a rectangle，the surface is clean with clear cross striations and strong three-dimensional senseand it can record the transient outward potassium current up to 3000 pA. Conclusion Survival rate of cell of the method applied in the experiment and transient outward potassium current can be recorded.

[Key words] Myocardial cell；Transient outward potassium current；Pacth clamp technique

成年大鼠心肌细胞的分离方法步骤比较复杂，条件要求很高，影响因素较多，不易获得高质量的心肌细胞，心肌细胞酶分离是难点，是膜片钳实验记录电流的基础。40多年来，酶解法被用于成年大鼠的心肌分离，到目前为止，尚无统一方法可循[1-2]，本实验采用两步酶解法分离出较好形态的心肌细胞，并且能记录到瞬时外向钾电流。

1 材料与方法

1.1实验动物

SD大鼠，清洁级，体重180～220 g，购于第三军医大学医学实验动物中心，试验中对动物处置符合伦理学标准。

1.2 药品与试剂

氯化钴（CoCl2），乙二醇双四乙酸（EGTA），血清白蛋白（albumin），羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），牛磺酸（taurine），胶原酶Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Worthington），谷氨酸（glutamic acid），天冬氨酸钾（K-aspartate）均为Sigma公司产品，其余为国产分析纯试剂。

1.3溶液配制

心肌细胞分离又一影响因素是温度。放置心脏于4℃无钙台液中，能降低心肌氧耗量，保护心肌。25～30℃室温下进行心肌细胞分离，灌流液温度37～38℃[10]。由于恒温装散热，应测量心脏悬挂端流出液温度，据流出液温度调整恒温水浴的温度。文献报道细胞可在常温下静置保存，也可在37℃二氧化碳卵浮箱内保存[11]。在本实验中细胞存放在4℃冰箱内，这样细胞代谢降低，氧耗量降低，细胞保存时间会延长。

以往国内外常采用Langendorff四步酶解法来分离心肌细胞[2]。现在大多采用两步酶解法：①无钙台液灌流；②酶液灌流。本实验在龙毅[12-13]等报道的急性酶分离大鼠心房肌细胞方法的改进基础上操作，缩短心脏灌流的时间，减轻心肌缺血、缺氧时间，有利保存心肌细胞[14]。第一步灌流时间尽量在5 min内，只要心脏流出液为清亮色，心脏停止跳动即停止灌流。第二步酶液灌流：酶作用的强弱不同和种类不同，灌流速度不同，灌流的时间也不同。本实验灌流速度为8 ml/min，消化时间为6～15 min。消化开始时心脏呈红褐色，质软，酶解过程中心脏体积增大，发白变硬，后期肿胀发白塌陷。换酶液6 min后，每隔1分钟取1小块左心室组织，共取10次，可获得稳定且质量高的心肌细胞。

文献报道处死大鼠方式有非麻醉法与麻醉法。多采用麻醉方法取心脏，麻醉可快速取心脏，缩短了悬挂心脏时间。若采用棒击法或者断颈法取心脏，操作者要非常熟练，熟练程度不够会影响心肌细胞的获得取。麻醉过深导致呼吸抑制，心肌细胞的获得也会受影响。

钙反常指无钙溶液中分离的细胞当再次进入生理浓度钙溶液中，细胞会不停地收缩，渐渐变圆，失去原来有序结构和收缩功能直至溶解[15]。减少钙反常的方法是改进实验方法，完善实验条件，提高心肌细胞质量，要求熟练操作，适当实验条件控制。本方法分离的心肌细胞能耐钙，成活率高。

注意整个操作过程中充氧，各种灌流液不能有气泡，气泡可堵塞冠状动脉，常规肝素化抗凝防血块堵塞冠状动脉，所有的操作都要熟练。

[参考文献]

[1] Bkaily G，Sperelakis N，Doane J.A new method for preparation of isolated single adult myocytes[J].Am J Physiol，1984，247（6）：H1018-H1026.

[2] Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes？[J].Cardiovasc Res，1994，28（2）：280-283.

[3] Isenberg G，Klockner U.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium"[J].Pflugers Arch，1982，395（1）：6-18.

[4] Armoundas AA，Wu R，Juang G，et al.Electrical and structural remodeling of the failing ventricle[J].Pharmacol Ther，2001，92（2-3）：213-230.

[5] 王华，曾晓荣.细胞内钙浓度变化对心房肌小电导钙激活钾通道电流的影响[D].成都：泸州医学院，2012.

[6] 刘振伟.实用膜片钳技术[M].北京：军事医学科学出版社，2006：90-103.

[7] 邢斌，招明高，王海芳，等.成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性[J].心脏杂志，2002，14（3）：2102-2103.

[8] 张丹，王鑫，王晞，等.心肌细胞的急性分离及瞬时外向钾电流的记录[J].医学研究生学报，2010，23（8）：792-794.

[9] 朱肖星，牛小麟，朱萧玲，等.不同活性的胶原酶对大鼠心肌细胞分离的影响[J].解放军医学杂志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 张华，刘惠亮，杨胜利，等.缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化[J].医学研究生学报，2009，22（1）：12-15.

[11] 张军，宋俊丽，武冬梅.膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龙毅，周亚南，殷跃辉.急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、 钙电流的记录[J].重庆医科大学学报，2011，36（8）：910-912.

[13] 王腾，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌细胞的分离技术及电生理鉴定[J].科技导报，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）

文献报道处死大鼠方式有非麻醉法与麻醉法。多采用麻醉方法取心脏，麻醉可快速取心脏，缩短了悬挂心脏时间。若采用棒击法或者断颈法取心脏，操作者要非常熟练，熟练程度不够会影响心肌细胞的获得取。麻醉过深导致呼吸抑制，心肌细胞的获得也会受影响。

钙反常指无钙溶液中分离的细胞当再次进入生理浓度钙溶液中，细胞会不停地收缩，渐渐变圆，失去原来有序结构和收缩功能直至溶解[15]。减少钙反常的方法是改进实验方法，完善实验条件，提高心肌细胞质量，要求熟练操作，适当实验条件控制。本方法分离的心肌细胞能耐钙，成活率高。

注意整个操作过程中充氧，各种灌流液不能有气泡，气泡可堵塞冠状动脉，常规肝素化抗凝防血块堵塞冠状动脉，所有的操作都要熟练。

[参考文献]

[1] Bkaily G，Sperelakis N，Doane J.A new method for preparation of isolated single adult myocytes[J].Am J Physiol，1984，247（6）：H1018-H1026.

[2] Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes？[J].Cardiovasc Res，1994，28（2）：280-283.

[3] Isenberg G，Klockner U.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium"[J].Pflugers Arch，1982，395（1）：6-18.

[4] Armoundas AA，Wu R，Juang G，et al.Electrical and structural remodeling of the failing ventricle[J].Pharmacol Ther，2001，92（2-3）：213-230.

[5] 王华，曾晓荣.细胞内钙浓度变化对心房肌小电导钙激活钾通道电流的影响[D].成都：泸州医学院，2012.

[6] 刘振伟.实用膜片钳技术[M].北京：军事医学科学出版社，2006：90-103.

[7] 邢斌，招明高，王海芳，等.成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性[J].心脏杂志，2002，14（3）：2102-2103.

[8] 张丹，王鑫，王晞，等.心肌细胞的急性分离及瞬时外向钾电流的记录[J].医学研究生学报，2010，23（8）：792-794.

[9] 朱肖星，牛小麟，朱萧玲，等.不同活性的胶原酶对大鼠心肌细胞分离的影响[J].解放军医学杂志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 张华，刘惠亮，杨胜利，等.缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化[J].医学研究生学报，2009，22（1）：12-15.

[11] 张军，宋俊丽，武冬梅.膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龙毅，周亚南，殷跃辉.急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、 钙电流的记录[J].重庆医科大学学报，2011，36（8）：910-912.

[13] 王腾，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌细胞的分离技术及电生理鉴定[J].科技导报，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）

文献报道处死大鼠方式有非麻醉法与麻醉法。多采用麻醉方法取心脏，麻醉可快速取心脏，缩短了悬挂心脏时间。若采用棒击法或者断颈法取心脏，操作者要非常熟练，熟练程度不够会影响心肌细胞的获得取。麻醉过深导致呼吸抑制，心肌细胞的获得也会受影响。

钙反常指无钙溶液中分离的细胞当再次进入生理浓度钙溶液中，细胞会不停地收缩，渐渐变圆，失去原来有序结构和收缩功能直至溶解[15]。减少钙反常的方法是改进实验方法，完善实验条件，提高心肌细胞质量，要求熟练操作，适当实验条件控制。本方法分离的心肌细胞能耐钙，成活率高。

注意整个操作过程中充氧，各种灌流液不能有气泡，气泡可堵塞冠状动脉，常规肝素化抗凝防血块堵塞冠状动脉，所有的操作都要熟练。

[参考文献]

[1] Bkaily G，Sperelakis N，Doane J.A new method for preparation of isolated single adult myocytes[J].Am J Physiol，1984，247（6）：H1018-H1026.

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[5] 王华，曾晓荣.细胞内钙浓度变化对心房肌小电导钙激活钾通道电流的影响[D].成都：泸州医学院，2012.

[6] 刘振伟.实用膜片钳技术[M].北京：军事医学科学出版社，2006：90-103.

[7] 邢斌，招明高，王海芳，等.成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性[J].心脏杂志，2002，14（3）：2102-2103.

[8] 张丹，王鑫，王晞，等.心肌细胞的急性分离及瞬时外向钾电流的记录[J].医学研究生学报，2010，23（8）：792-794.

[9] 朱肖星，牛小麟，朱萧玲，等.不同活性的胶原酶对大鼠心肌细胞分离的影响[J].解放军医学杂志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 张华，刘惠亮，杨胜利，等.缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化[J].医学研究生学报，2009，22（1）：12-15.

[11] 张军，宋俊丽，武冬梅.膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龙毅，周亚南，殷跃辉.急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、 钙电流的记录[J].重庆医科大学学报，2011，36（8）：910-912.

[13] 王腾，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌细胞的分离技术及电生理鉴定[J].科技导报，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：许俊琴）