纳米TiO2固载脂肪酶及其固载界面表征

周 朋，陶玉贵，曹 宁，张 健，刘任龙

（安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000）

脂肪酶又称三酰甘油酯水解酶（EC3.1.1.3），可以专一高效地催化分解甘油三酯，普遍存在于动植物和微生物中［1－3］.脂肪酶广泛应用于医药、化工、食品和化妆品等行业［4－5］.相较于游离酶而言，固定化酶有着更好的操作稳定性，有利于下游产物的分离纯化，便于回收重复利用［6］.

目前，利用纳米无机材料作为酶固定化的载体已得到广泛应用［7－8］.无机材料TiO2对有机物质具有较好的吸附性，生物亲和性好、无毒害，化学稳定性好，机械强度高，将会是很好的酶固定化载体［9－10］.在酶的固定化中，酶与载体表面的作用方式可能会引起酶结构的变异，增加底物与酶活中心的空间位阻，从而导致酶活力下降、酶固定量也受到限制.因而，研究酶蛋白在载体表面的界面特性是酶固定化的关键［11］.

本文在前期仿生合成纳米TiO2基础上，分别以仿生合成的纳米线、纳米花以及纳米片TiO2为载体进行脂肪酶固定化，进一步研究固定化效果最好的载体.采用SEM、XRD、FT－IR以及比表面积分析仪等表征固定化酶，对纳米TiO2载体固定脂肪酶的界面特性进行了初步探究.

1 实验部分

1.1 实验药品

脂肪酶，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，聚乙烯醇（PVP），无水乙醇，橄榄油，均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司；TiO2纳米线（锐钛矿，SBET＝312.58m2/g，Pore Radius Dv（r）＝16.69nm）、纳米花（TiO2/ZnO复合体，SBET＝219.54m2/g，Pore Radius Dv（r）＝18.53nm）以及纳米片（钛酸盐，SBET＝169.50m2/g，Pore Radius Dv（r）＝48.44nm）载体均为实验室自制.

1.2 酶固定化方法

在25mL浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH＝7.5）中加入一定量的酶粉，搅拌0.5h使之充分溶解.然后将0.5g载体（静置在pH＝7.0，浓度0.1mol/mL的磷酸缓冲溶液24h）加入脂肪酶的PBS中，室温下搅拌一定时间，过滤，将固定化酶用滤液反覆洗涤，收集滤液，滤液待用，以便测定滤液中酶的活力.所得的固体干燥至恒重，得到固定化酶.

1.3 蛋白负载率和酶活测定方法

固定化酶蛋白含量的测定采用Brandford法.

固定化效率（% ）＝（初始酶液总蛋白－残液总蛋白）/初始酶液总蛋白×100%.

固定化酶活力采用橄榄油乳化及NaOH滴定法测定.固定化酶活力单位：每克固定化酶在37℃下，每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸所需的酶量为1个活力单位（U/g）.

1.4 表征方法

采用日立S－4800扫描电子显微镜研究样品形貌；在Bruker D8Advance型X射线衍射仪上进行XRD表征，采用连续扫描方式，扫描范围2θ＝10°～80°；利用岛津IRPrestige－21傅立叶变换红外光谱仪研究样品中基团的变化；通过美国康塔NOVA 2000e比表面积及孔径分析仪测试样品的比表面积.

2 结果与讨论

2.1 纳米TiO2形貌对酶固载率的影响

分别以自制的线状、花状和片状TiO2为载体，在相同条件下固定化脂肪酶，再测定固定化酶的活力和固载率，实验结果如图1所示.由图1可知，3种载体中线型形貌载体的固载率最高，且酶活也较好.纳米线型的TiO2为纯的锐钛矿，在3种载体中具有较高的BET、孔径与脂肪酶也较为接近.因而，最终选择固定化效果最好的线型形貌TiO2为载体，并研究了固定化时间、温度、pH以及酶载量对固定化的影响.

2.2 纳米线TiO2固载脂肪酶的条件研究

（1）加酶量对固定化的影响.在25mL、pH为7.5磷酸盐缓冲液中分别加入0.1～1.6g的脂肪酶，于40℃下固定化6h，考察加酶量对固定化的影响，结果如图2所示.由图2可知，随着酶量的增加，固定化的固载率和固定化酶活性都呈现出先增后降的趋势.酶量达0.2g时，固载率和固定化酶活性均最高，此后再增加酶量，固载率和固定化酶活性呈现下降趋势.这可能是由于加酶量为0.2g时，吸附到载体上的脂肪酶已达到饱和，难以继续与反应介质中酶分子反应.因此，本实验采用0.2g作为最佳加酶量.

（2）pH对固定化的影响.在25mL、pH为6.0～8.5的磷酸盐缓冲液中加入0.2g的脂肪酶，于40℃下固定化6h，考察了反应体系pH值对固定化的影响，结果如图3所示.由图3可知，随pH的升高，固定化的固载率和固定化酶活性都呈现先升后降.当pH＝7.0时，固载率达到最高；而pH＝7.5时，固定化酶活性达到最高.综合考虑选择pH＝7.0为最适固定化pH.

图1 不同载体对固定化的影响

图2 加酶量对固定化的影响

图3 pH对固定化的影响

（3）固定化时间对固定化的影响.在25mL、pH为7.5磷酸盐缓冲液中分别加入0.2g的脂肪酶，于40℃下固定化1～9h，考察反应时间对固定化的影响，结果如图4所示.由图4可知，随着固定化时间的延长，固定化的固载率和固定化酶活性呈现增大的现象，但到一定条件后，固载率和酶活性的增加均趋向平缓.这可能是由于固定时间达到6h以后，TiO2载体的负载量也基本达到饱和，时间的延长，将不会增加酶的固载量.所以，固定化为6h已可以达到要求.

（4）固定化温度对固定化的影响.在25mL、pH为7.5磷酸盐缓冲液中分别加入0.2g的脂肪酶，于25～55℃下固定化6h，考察反应温度对固定化的影响，结果如图5所示.由图5可知，随固定温度的升高，固载率变化幅度较小，但对酶活性影响较大.在40℃时，固定化酶活性最高，随温度的升高酶活性迅速下降.原因是在高温下，酶活性部位遭到破坏，从而导致酶活性下降.综合考虑，以40℃为最佳的固载温度.根据上述单因素试验结果，确定pH、加酶量、吸附时间为影响脂肪酶固载率的3个显著因素.采用Box－Beheken统计学试验设计方法，对上述3个显著因素进行优化，得到3个条件的最佳组合为：pH为7.0、加酶量为0.25g、反应时间为6.3h，在此条件下，脂肪酶的理论固载率为80.12%.

2.3 纳米线TiO2固载酶及其界面表征

（1）SEM分析.纳米线TiO2固定前后的SEM图如图6所示.由图6a可知，载体为形貌较好、线条分明的纳米线，其直径在20～40nm之间，长度达几微米至十几微米，纳米线彼此交叉弯曲、相互交织.由图6b可知，絮状物是团聚在纳米线载体表面的脂肪酶.

图4 固定化时间对固定化的影响

图5 固定化温度对固定化的影响

图6 固定化前后样品的SEM图

（2）XRD分析.实验所用的纳米线TiO2具有一定的介孔性质，其孔径为16.69nm，较接近于脂肪酶的三维尺寸.当孔大小与蛋白质尺寸相当时，蛋白质在孔内的扩散系数远高于在溶液中［12］.蛋白质是否进入载体材料的孔道内，可根据XRD强度变化来判断，一般载体吸附蛋白质后XRD强度会下降［13］.纳米线TiO2固定前后的XRD图谱如图7所示.对比可知，固定化前后的样品均为无定形结构，虽然很难判断XRD衍射强度是否下降，但可明显看出固定化前后两者的XRD图谱存在区别，一定程度证明了脂肪酶与载体纳米线发生了作用.

（3）FT－IR分析.FT－IR对固载酶蛋白质分子与载体的界面表征，结果如图8所示.由图8可知，游离脂肪酶（见图8a）在1 651cm－1和1 533cm－1出现了红外特征峰，分别属于氨基I区和氨基II区.其中氨基I区（1 600～1 700cm－1）来自于蛋白质的ɑ－螺旋、β－折叠、β旋转以及无规则卷曲.酰胺II区（1 500～1 600cm－1）为C－N伸缩振动和蛋白质骨架的N－H弯曲振动［14］.对比可见，固定化酶（见图8c）中也明显含有这两个特征吸收峰，从而证明游离的脂肪酶已固载于TiO2载体上，可能是由于脂肪酶在载体界面上二级结构发生变化，与文献［15］报道一致.

（4）比表面积及孔径分析.实验中所用纳米线载体具有较高的比表面积，同时具有介孔性质.当脂肪酶固定到纳米线上，会引起纳米线载体比表面积和孔径上的改变.对固定化前后的样品进行N2吸附－脱附实验，结果如图9和表1所示.由图9可知，两者均属于Ⅴ型等温线，且表现出一定的磁滞现象，但两者存在明显的区别.由表1可知，固定化酶的比表面积和平均孔径均小于纳米线载体，这说明脂肪酶结合到纳米线载体的表面和空隙内.

图7 固定化前后样品的XRD图谱

图8 样品的FT－IR图谱

图9 样品的N2吸附－脱附等温线

表1 样品的比表面积及孔径分析数据

3 结论

本文讨论了3种不同形貌的TiO2为载体固定化脂肪酶，对固定化效果更好的纳米线TiO2载体固定化脂肪酶做了进一步研究.通过单因素实验确定最佳条件，其中加酶量、pH、固定化时间的影响更为显著.采用响应面实验设计方法对加酶量、pH和固定化时间3个条件进行优化，得到最优的组合为加酶量0.25g、pH 7.0、固定化时间6.3h.在此条件下，脂肪酶的理论固载率为80.12%.研究了纳米二氧化钛固定脂肪酶的界面特性.采用SEM、XRD、FT－IR以及比表面积分析仪等进行表征，结果显示，在纳米线形貌的载体上存在脂肪酶的吸附.

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