片形吸虫成虫虫体抗原制备及ELISA实验研究

陈 凤，李科荣，杨 敬，郝明明，罗家军，刘榆华

（大理州血吸虫病防治研究所，云南大理 671000）

片形吸虫为家畜常见的寄生虫，在分类上隶属于吸虫纲复殖目片形科（Fasciolidae）片形属（Fasciola），在我国主要分布有两种：肝片形吸虫（Fasciola hepatica）和大片形吸虫（F.gigantica），虫体寄生于牛羊等反刍动物的肝脏胆管中，也寄生于人体〔1〕。片形吸虫病（Fascioliasis）是由片形吸虫（Fasciola spp.）感染引起的人兽共患病〔2〕，片形吸虫在世界各地均有流行，主要在欧州，亚洲的人体感染病例较少〔3-6〕，国内对人体片形吸虫病的报道不多，至2007年国内共报道224例片形吸虫病病例，多为散发，且以流行病学调查方式发现的病例占多数〔7-9〕。至2012年1月云南省宾川县爆发大片形吸虫病〔10〕，片形吸虫才成为大理地区较为关注人体寄生虫病之一。由于片形吸虫在人体组织移行期较长，免疫学检测在早期诊断尤为重要，但目前市场上用于片形吸虫病检测的试剂盒主要是德国DRG公司生产的肝片吸虫病ELISA检测试剂盒，国内还没有成品的商品试剂盒问世〔11〕。为探索片形吸虫病检测方法或试剂，建立适用于基层的检测系统，以期用于寄生虫病爆发时疫情处置及协助临床诊断疑难寄生虫病例，我们选择试用云南大理本地的片形吸虫成虫虫体可溶性粗抗原，建立ELISA（FAWA-ELISA）检测法对本地感染的片形吸虫病例进行检测，于2013年8月至2014年1月在大理州血吸虫病防治研究所中心实验室进行了相关实验，取得较满意的效果，现将实验过程及结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 片形吸虫 牛体片形吸虫成虫采自大理市农贸市场牛肝胆管，形态学初步鉴定为肝片形吸虫。

1.2 血清 大片吸虫病患者血清共26份，为2012年流调时同期采集的患者血清，其中1份为经病原学诊断的确诊患者血清，其余为临床诊断病例。其他寄生虫病患者血清共102份，其中斯氏狸殖吸虫病血清3份（病理学确诊）、慢性血吸虫病血清24份（病原学确诊）、急性血吸虫病20份（病原学确诊）、旋毛虫病患者血清21份（全部为临床诊断患者血清）、囊虫病患者血清21份（全部均通过影像学确诊，其中混合型囊虫病例6例、脑囊虫病15例）、广州管圆线虫病例12份（全部为临床诊断病例）、包虫病病例1例（手术确诊），所有血清均来自本所血清库。健康人血清共25份，来自本所血清库。

1.3 试剂和仪器

1.3.1 试剂 96孔酶标板购自浙江拱东医用塑料厂，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG（HRP-IgG）、牛血清白蛋白（BSA）购自美国SIGMA公司，TMB显色液购自中国TIANGEN公司。

1.3.2 仪器 DNM-9602型酶标仪购自北京普朗公司；TM-01100-26型数字恒温电热恒温培养箱购自美国BOOKEL公司；微量移液器购自德国BRAND公司；TU-1800PC紫外分光光度计购自北京普析公司。

1.3.3 抗原的制备 参照文献〔12〕并结合本所实验室条件进行制备。取牛体片形吸虫成虫加PBS或生理盐水在冰上研磨至匀浆，分装到1.5 mL离心管8000 r/min，4℃离心10 min，取上清液转移至另一支离心管，重复8000 r/min，4℃离心10 min，取上清液即为虫体抗原，测蛋白浓度备用。用紫光分光光度法测得蛋白含量为17 mg/mL。

1.4 实验方法

1.4.1 ELISA操作 方法参照文献〔11〕并进行了一些改进，实验所用包被液、稀释液、洗涤液等均为我所自行配制（配方略）。以棋盘滴定的方式寻找到酶结合物工作浓度为1：10000时的最适抗原浓度为20 μg/mL，将制备好的成虫可溶性抗原分别用0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释成20 μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶标板，4℃过夜，1%BSACB封闭液200 μL/孔37℃封闭2 h，用含0.05%吐温20的PBS（PBST）洗板4次，每次静置3 min。拍干，加1：100待检血清100 μL（用1%BSA-PBST 稀释），37℃ 1 h，用PBST洗涤4次，每次静置3 min，加HRP-IgG 100 μL（用1%BSA-PBST 稀释），37℃，0.5 h，PBST洗涤4次，每次静置3 min，加TMB显色液室温避光孵育5 min，2 mol/L H2SO4液终止反应，用酶标仪测定吸光度（A450nm为测量波长，A630nm为参比波长）。每板设两孔空白对照、两孔阴性对照、两孔阳性对照。根据重复测定阳性参考血清及阴性血清A值，确定阈值，计算实验的敏感度特异度及交叉反应率。并对实验的重复性、稳定性（精确度）进行测试。以下简称FAWA-ELISA检测法。

1.4.2 样本检测 分别用上述方法检测26份大片吸虫病患者血清（P1-P26）、102份其他患者血清和25份健康人血清。其中，P1-P6为精密度样品。

1.4.3 数据分析 采用Microsoft Office Excel 2003结合SPSS17.0进行统计分析，计算A/CO值，以及诊断试验的各种评价指标。

2 结果

2.1 精确度（重复性）比较 FAWA-ELISA检测大片吸虫病患者精密度血清样品P1-P6，以中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所大片吸虫试剂盒检测血清抗体滴度为高（P1-P2）、中（P3-P4）、低（P5-P6）血清样本的均数、标准差、变异系数见表1，其批内变异、批间变异（CV）均＜15%，表明试剂精密度、重复性较好，可应用于实验研究。

2.2 CUT-OFF值的确定 为选择适合的截断点作为阴阳性的分界，我们以吸光度A值作为诊断指标寻找截断点（CUT-OFF值），选取ROC曲线坐标值作为参考，ROC曲线坐标显示，当截断点取A值为0.344的时候，约登指数等于0.992，为最高值，此后逐渐下降，但结合目测结果，通常ELISA实验阴性参考A值大于0.12肉眼即出现可见微蓝，阴参A值大于0.15一般视为实验无效，故CUT-OFF取值以阴参值在0.06～0.15之间时所设值较合理，否则在没有酶标仪的情况下无法目测判定结果；阴参值在0.06～0.15之间时2.1倍阴参作为临界值的取值范围为（0.126～0.315），此范围内确立的截断点其约登指数在0.89～0.99之间，故我们以空白调零样品孔A值＞阴性对照A值均数的2.1倍作为阳性结果的阈值（CO），此阈值设定较适于不同批次、不同实验室、不同现场的应用，并以此计算实验的敏感度、特异度及交叉反应率。见表2。

表1 FAWA-ELISA法检测大片吸虫病患者血清精密度

表2 FAWA-ELISA不同截断点时的敏感度、特异度

2.2.1 ELISA实验结果 FAWA-ELISA检测26例大片形吸虫病例全部阳性，阳性率100%（26/26），其他寄生虫病及健康人交叉反应阳性分别如下：急性血吸虫病患者交叉阳性率为5%（1/20）、慢性血吸虫病患者4.17%（1/24）、旋毛虫病患者4.76%（1/21），与斯氏狸殖吸虫病患者血清交叉阳性率为100%（3/3）、广州管圆线虫0%（0/12）、囊虫0%（3/21）、包虫0%（0/1），健康人0%（0/25）。见表3。

表3 FAWA-ELISA法检测大片吸虫病人、其他寄生虫病患者及健康人血清结果

2.2.2 敏感性和特异性 由表3可得出FAWAELISA检测法的敏感性为100.0%，特异性为95.28%（95%CI：98.9%～91.2%）、阳性预测值为81%（95%CI：94.7%～67.7%）、阴性预测值为100%，阳性似然比为21.17，阴性似然比0，约登指数为0.95。

2.2.3 A值比较 FAWA-ELISA对片形吸虫病例检出率为100%（26/26），与文献〔11〕报告检测的检出率一致（血清为云南宾川爆发时采集的同一批病例血清）；且通过酶标仪进行A值结果判读分析，片形吸虫病例血清的A值均值为0.523，交叉反应阳性血清A值均值为0.226，片形吸虫病例血清阳性A值明显高于交叉反应阳性A值（t=6.7，P ＜0.01），FAWA-ELISA检测26例大片吸虫病患者血清的A/CO均值为3.29，明显高于交叉反应阳性血清A/CO均值1.56（t=6.07，P ＜ 0.01），也明显高于文献〔11〕Fg-ELISA的1.7（t=15.12，P ＜ 0.0001），各血清组A值见图1。

3 讨论

我国多数省都有两种片形吸虫存在〔13〕，2012年云南宾川地区片形吸虫感染调查也证实了这一点〔14〕。片形吸虫的成虫和虫卵在形态上者较难区分，鉴定片形吸虫的种类还需要分子生物学的方法予以辅助〔14〕。我们制备抗原的片形吸虫从形态学上初步鉴定为肝片形吸虫，但由于实验室条件限制没有进行分子生物学鉴定，故在实验上无法准确区分判定为大片吸虫还是肝片吸虫。通过文献研究了解到大片吸虫粗抗原与肝片吸虫粗抗原的蛋白成分基本相同〔15〕，且大片吸虫和肝片吸虫感染后所造成的临床损害与治疗方法均一致〔13〕，故我们认为不影响FAWA-ELISA检测方法的使用，在基层有限的条件下可以先筛检出病人救治病人之后再以上级机构专业的试剂盒鉴定为何种片形吸虫感染，再结合分子生物学方法进行确诊。同时，通过本次实验我们再次验证了宾川暴发的片形吸虫病例的血清，得出与文献〔10〕一致的结果（26例片形吸虫病例阳性率100%），通过重复试验也确定了这次疫情诊断的准确性，如果有相似疫情暴发，我们可以用该方法协助诊断。

图1 FAWA-ELISA试剂盒检测大片吸虫病、其他寄生虫病患者及健康人血清结果比较

FAWA-ELISA检测方法的敏感性分别为100.0%，特异性分别为95.28%，与文献〔11〕报道的较好的片形吸虫病检测方法Fg-ELISA相比，敏感性、特异性与Fg-ELISA一致（u=0.46，P ＞0.05），且通过酶标仪进行A值结果判读分析，FAWA-ELISA检测26例大片吸虫病患者血清的A/CO均值为3.29，明显高于文献〔11〕Fg-ELISA的1.7（t=15.12，P ＜ 0.0001），这是否是由于用本地牛体片形吸虫制备的抗原对于本地感染的片形吸虫病例免疫原性更好还有待研究，但至少可以说明我们建立的FAWA-ELISA同样适于片形吸虫病流行区进行大规模的初步筛查应用。

FAWA-ELISA检测方法的阳性预测值分别为81.25%，阴性预测值分别为100%，说明检测时不易出现漏检的情况，但出现假阳性的概率较大，尤其是在血清质量较差的情况下。在与其他寄生虫病患者血清交叉反应的观察中，发现本次实验结果与文献〔11，16〕报告的较一致，即片形吸虫抗原与其他吸虫（主要是肺吸虫）交叉反应较大而与线虫、绦囊虫交叉较小，与急性血吸虫病患者血清交叉阳性率分别为5%（1/20）、慢性血吸虫病患者4.17%（1/24）、旋毛虫病患者4.76%（1/21），与斯氏狸殖吸虫病患者血清交叉阳性率为100%（3/3），与囊虫包虫交叉反应为0（0/22）。表明该方法在区分吸虫类寄生虫感染，尤其是并殖吸虫感染时意义不大，这可能与吸虫同类之间交叉抗原有关。但由于云南是华支睾吸虫的流行区但尚未发现本地感染华支睾吸虫病病例故暂不是华支睾吸虫病流行区，而且大理州除剑川县外也不是肺吸虫流行区，大理州内也尚未发现本地感染的肺吸虫病例〔17〕，故可排除在大理本地感染肺吸虫与华支睾吸虫的可能性；而与片形吸虫同属片形科的布氏姜片吸虫感染由于没有肝部表现可通过（CT、MRI、彩超）等区别；片形吸虫和血吸虫在大理州流行区有可能交叉，但也可通过流行病学史、临床表现和辅助检查（CT、MRI、彩超等）可区分血吸虫与片形吸虫感染。同时FAWA-ELISA实验的阳性似然比为27.17，阴性似然比为0，说明FAWA-ELISA实验判断为阳性时是病人的可能性是健康人的27倍，FAWA-ELISA实验判断为阴性时是病人的可能性几乎为0，结合临床分析可协助诊断。且发现片形吸虫病例血清阳性A值明显高于交叉反应阳性A值（t=6.7，P＜0.001），通过酶标仪测定A值，在报告阴阳性同时报告A/CO值，可以提高报告的准确性。

所以用此条件建立的片形吸虫ELISA方法可以试用于大理州乃至云南省片形吸虫流行病学调查，以血清学进行过筛，再结合粪检进行查病，可大大减轻粪检的工作量。在没有更好的片形吸虫病检测方法或成品试剂盒问世之前还可试用于片形吸虫疑似病例的临床样本检测参考。

致谢：感谢中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所许学年、周岩、程娜老师，感谢中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所；感谢大理州血吸虫病防治研究所方文主任医师对本实验提供的帮助。

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