小牛脾提取物注射液对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

孙燕，王冬梅

（山东莱芜职业技术学院 生物制药教研室，山东 莱芜 271100）

小牛脾提取物注射液对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

孙燕，王冬梅

（山东莱芜职业技术学院 生物制药教研室，山东 莱芜 271100）

目的研究小牛脾提取物注射液（calf spleen extractive injection，CSEI）对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。方法取BALB/c小鼠120只，按照随机数字表分为正常组（n=20）、模型组（n=20）、阳性对照组（胸腺肽，n=20）、CSEI高剂量组（1．20 mL/kg，n=20）、CSEI中剂量组（0．60 mL/kg，n=20）、CSEI低剂量组（0．30 mL/kg，n=20）。除正常组外，第 1、2、3 天腹腔注射环磷酰胺（80 mg/kg）造成免疫功能低下模型，连续给药 10 d后，以脏器指数、吞噬指数、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)杀伤率、外周血白细胞（white blood cell，WBC）计数、淋巴细胞（lymphocytes，LYM）计数及血清抗羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）IgG水平为考察指标，验证CSEI对免疫功能低下小鼠免疫功能的调节作用。结果与模型组相比，高、中、低CSEI组均能显著提高能够免疫功能低下小鼠脏器指数、吞噬指数、NK细胞杀伤活性、血清特异抗SRBC的IgG水平以及升高外周血白细胞及淋巴细胞计数（P＜0．05）。结论CSEI对免疫功能低下小鼠免疫功能具有增强作用。

小牛脾提取物；免疫功能低下；免疫调节

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 CSEI（吉林敖东洮南药业股份有限公司生产，批号：20121007），每支含多肽5 mg，核糖380 μg；注射用胸腺肽（长春生物制品研究所生产，批号：20120605）。胎牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司，批号：20081028）；RPMI-1640 培养液（Gibco 公司）。

Bio-rad 680型酶标仪（美国伯乐Bio-rad公司），CO2培养箱（日本三洋公司），TGL-16 G-A型低温离心机（上海安亭科学仪器厂）。

BALB/c小鼠，ICR小鼠，清洁级，由山东莱芜职业技术学院实验动物中心提供，动物合格证号：（吉）2012-0005。L929细胞株由山东省肿瘤医院提供。

1.2 分组及处理 将120只20～22 g BALB/c小鼠随机分为正常对照组（n=20）、环磷酰胺模型对照组（n=20）、环磷酰胺与阳性药胸腺肽（10 mg/kg）联用组（n=20）、环磷酰胺分别与 CSEI高、中、低（1.20，0.60，0.30 mL/kg）剂量联用组（每组n=20），每天1次，连续干预10 d。正常对照组及模型对照组肌肉注射相同体积的生理盐水，在给药第1、2、3天，模型对照组与各给药组分别腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，正常对照组腹腔注射相应体积的生理盐水。

2 实验方法

2.1 CSEI对免疫功能低下小鼠免疫器官以及NK细胞活性[8]的影响 末次给药24 h后，称量体质量，摘出胸腺及脾，称重，计算胸腺指数和脾脏指数，即相应脏器质量（mg）除以体质量（g）。无菌条件下取脾脏制成脾细胞悬液，1500 r/min离心2次，加红细胞裂解液2 mL 37℃静置5 min，离心弃上清，Hanks洗涤2次，调整浓度为1×107/mL做为效应细胞备用。将传代培养的L929细胞在试验前一天换液，实验时细胞浓度调至2×105/mL作为NK细胞的靶细胞。将靶细胞0.1 mL/孔加入96孔培养板中，放入5%CO2的37℃培养箱中培养1 h后，向每孔加入0.1 mL效应细胞（使效靶比例为50︰1），每个样品设4个复孔。靶细胞对照孔加入培养液0.1 mL，5%CO2的37℃培养箱培养20 h，弃上清，37℃生理盐水洗涤3次，以除去效应细胞及被杀死而脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分，每孔加入0.1%的中性红染液0.1 mL，5%CO2的37℃培养箱培养30 min，弃去染液，生理盐水洗涤3次后，每孔加入0.1 mL细胞裂解液摇匀。酶标仪波长570 nm处测定光密度（OD）值，并计算杀伤率（%）=（靶细胞OD值－实验组OD值）/靶细胞OD值×100%。

2.2 CSEI对免疫功能低下小鼠WBC的影响 末次给药1 h后，小鼠尾部采血，血常规测定WBC及LYM计数。

2.3 CSEI对免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能[9]的影响 按上述方法分组给药。第10 d给药1 h后，每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4 mL，8 h后将动物处死，无菌条件下经腹腔注入生理盐水2 mL，转动固定板1 min，然后抽取腹腔液1 mL滴于载玻片上，每片0.2 mL，共2片，置于37℃孵箱中温育30 min，取出玻片，漂洗以除去未贴片的细胞。晾干，以丙酮-甲醇液（1︰1）固定5 min，4%姬姆萨-瑞特氏染色液染色3 min，漂洗，晾干。在显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，按下列公式计算吞噬指数：

2.4 CSEI对免疫功能低下小鼠血清IgG水平的影响 将120只20～22 g的BALB/c小鼠随机分为正常对照组、环磷酰胺模型对照组、环磷酰胺与阳性药胸腺肽（10 mg/kg）联用组、环磷酰胺与 CSEI高、中、低（1.20，0.60，0.30 mL/kg）剂量联用组，每天1次，连续干预10 d。在实验第1天腹腔注射20%SRBC 0.2 mL初次免疫，第7天注射20%SRBC 0.2 mL再次免疫小鼠。处死动物前禁食12 h，取血，制备血清，采用ELISA法检测血清中IgG含量。

3 结果

3.1 CSEI对免疫功能低下小鼠胸腺、脾脏指数、NK细胞杀伤活性的影响 CSEI对免疫功能低下小鼠胸腺、脾脏指数、NK细胞杀伤活性的影响结果见表1。

表1 CSEI对免疫功能低下小鼠胸腺、脾脏重量、NK细胞杀伤活性的影响Tab.1 The effect of CSEI on thymus, spleen weight, killing activity of NK cells in immunocompromised mice

3.2 CSEI对免疫低下小鼠WBC、LYM、巨噬细胞吞噬功能的影响 CSEI对免疫低下小鼠WBC、LYM、巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表2。

表2 CSEI对免疫低下小鼠WBC、LYM、巨噬细胞吞噬功能的影响Tab.2 The effect of CSEI on WBC, LYM, phagocytosis of macrophage in immunocompromised mice

3.3 CSEI对免疫功能低下小鼠血清IgG水平的影响CSEI对免疫功能低下小鼠血清IgG水平的影响结果见表3。

表3 CSEI对免疫功能低下小鼠血清IgG水平的影响Tab.3 The effect of CSEI on serum IgG levels in immunocompromised mice

4 讨论

小牛脾提取物注射液属小分子多肽类物质，其是由提取自健康胎牛脾脏，为临床常用可提高机体免疫力的药物。本药在多种肿瘤的治疗中均有应用。目前临床对本药的作用机制研究显示，其作用机制可包括激活机体的免疫系统、刺激通细胞分裂素抑制素分泌、诱导抗肿瘤因子释放，刺激骨髓内干细胞增值等，临床可用于多种恶性肿瘤的辅助治疗[11-13]。

本实验采用环磷酰胺建立小鼠免疫功能低下模型，以脏器指数、吞噬指数、NK细胞杀伤率、外周血白细胞及淋巴细胞计数、血清抗SRBC特异抗体水平为检测指标，考察CSEI对免疫低下小鼠免疫功能的调节作用。

结果显示：模型组脾指数、胸腺指数、NK细胞杀伤率极显著性降低（P＜0.05）。胸腺肽组胞可升高小鼠脾指数、胸腺指数、NK细胞杀伤率（P＜0.05）。由此可见对于存在免疫功能低下的小鼠体内脾指数、胸腺指数、NK细胞杀伤率均降低，同时可经胸腺肽治疗而提高。同时本研究有又对应用不同剂量CSEI治疗的临床效果进行分析，结果显示，3组不同剂量的CSEI治疗均可提高脾指数、胸腺指数及NK细胞杀伤率（P＜0.05）。可见应用CSEI治疗可显著提高小鼠的体内免疫组织功能。

同时模型组小鼠WBC、LYM及吞噬指数显著性降低（P＜0.05）。与模型组比较，同样为胸腺肽组可显著升高小鼠WBC、LYM及吞噬指数（P＜0.05）。CSEI高、中、低剂量组可显著性升高小鼠WBC、LYM，NK细胞杀伤活性及吞噬指数（P＜0.05）。可见应用CSEI可显著改善小鼠外周血WBC及LYM计数。可见在免疫功能低下的小鼠体内WBC、LYM数量相对降低，其与免疫功能低下密切相关。此外对不同剂量CSEI的治疗效果显示：CSEI可提高小鼠血清机体水平。

目前临床观察显示，CSEI提高免疫功能的作用机制为CSEI可它刺激机体自身的免疫系统密切相关[14]。其可以促进机体释放多种细胞因子，同时可刺激淋巴母细胞生成，通过多种机制共同作用于机体，整体全面的提高机体的免疫功能[15-16]。此外，其抗癌机制则主要与其作用于肿瘤细胞的特殊时期密切相关，在阻滞了恶性肿瘤细胞进一步向前转化，从而达到一致肿瘤细胞生长的作用。

本研究免疫指标检测结果显示，CSEI可显著上调小鼠免疫功能低下小鼠的脏器指数、NK细胞杀伤活性、巨噬细胞吞噬功能以及外周血白细胞、淋巴细胞数。CSEI亦能提高免疫低下小鼠血清抗SRBC特异抗体水平。

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Immunomodulatory effect of calf spleen extractive injection on immunocompromised mice

SUN-Yan, WANG Dong-mei
(Departmert of Pharmaceuticals,Laiwu Vocational and Technical College,Laiwu 271100,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Calf Spleen Extractive Injection(CSEI) on immune function of immunocompromised mice.MethodsBALB/C mice were divided into normal group (n=20), model group (n=20) and positive control group (n=20), CSEI high dose group (1.20 mL/kg, n=20), middle dose group (0.60 mL/kg, n=20) and low-dose group (0.30 mL/kg, n=20). Besides the normal group, mice in other groups were intraperitoneal injected cyclophosphamide at dose of 80 mg/kg for three consecutive days to induce immunocompromised model. Continuous dosing after 10 days to viscera index, index, natural killer cells (natural killer cell, NK) kill rate, the number of peripheral blood leukocytes (white blood cell, the WBC), lymphocyte count (lymphocytes, LYM) and serum against sheep red blood cells (the Sheep Red blood cell, SRBC) IgG levels as examining index,verify the CSEI effect on the regulation of immune function was low immune function in mice.ResultsCompared with model group, CSEI groups of high middle and low dose had improved viscera index, phagocytic coefficient, NK cell killing activity, serum specific antibody level, peripheral WBC count and lymphocyte count(P＜0.05).ConclusionCSEI has possess immunomodulatory effects on the immunocompromised mice.

calf spleen extractive;immunocompromised;immunomodulatory

R 967

A

1005-1678(2014)02-0058-03

CSEI（calf spleen extractive injection，CSEI）是以健康乳牛（出生24 h）脾脏为原料提取而成的无菌水溶液，主要成分为多肽及核糖[1]。临床上可用于治疗原发性血小板减少症，放射线引起的白细胞减少症，各种恶性肿瘤，改善肿瘤患者恶液质[2-3]等。目前研究显示：脾脏和胸腺指数是反应免疫功能的初步指标[4-5]，而巨噬细胞吞噬指数，NK细胞杀伤活性是反应免疫功能的重要指标[6-7]，此外外周围血中的白细胞包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及血清抗体水平均可作为评价免疫功能的主要参数[8-9]。本实验采用腹腔注射环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下模型[10]，以脏器指数、吞噬系数、NK细胞杀伤率、外周血白细胞和淋巴细胞数以及血清特异性抗SRBC抗体水平为考察指标，考察CSEI对免疫功能低下小鼠免疫调节作用，为临床应用提供依据。

孙燕，女，硕士，讲师，研究方向：生物制药技术，E-mail：sy800210@163.com。