松树皮原花青素抑菌作用稳定性的研究

白晶，苑庆爽，李炜玲

（大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044）

松树皮原花青素抑菌作用稳定性的研究

白晶，苑庆爽，李炜玲Δ

（大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044）

目的评估松树皮原花青素抑菌作用的稳定性。方法采用K-B纸片扩散法：以松树皮原花青素为材料，以常见腐败细菌为供试菌种，观察松树皮原花青素的抑菌活性以及温度、pH值、紫外线对其抑菌活性的影响。结果松树皮原花青素对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)有明显的抑制作用，松树皮原花青素对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）分别为12．5 mg/mL和6．25 mg/mL，在pH值偏中性时对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有较好的抑制效果，温度及紫外线对其抑菌作用影响较小，而对革兰阴性菌(大肠埃希氏菌及铜绿色假单胞菌)则无明显抑制作用。结论松树皮原花青素对革兰阳性菌有明显的抑制作用，在pH 6～pH 7范围内对综合杀菌效果较强，温度和紫外线对其抑菌作用几乎没有影响，其抑菌作用受外界影响小，稳定性好。

松树皮原花青素；纸片扩散法；抑菌作用；稳定性；革兰阴性菌；革兰阳性菌

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与仪器 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus Sukatilis）（美国ATCC菌种库）。固体培养基所用的材料购自北京希凯创新科技有限公司、天津市申泰化学试剂有限公司和北京奥博星生物技术有限责任公司。松树皮提取物原花青素购自陕西森弗高科实业有限公司。青霉素G（C 001）和庆大霉素为杭州天河微生物试剂有限公司产品。主要设备包括：自动式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂，LDZX-40 B）、电热恒温鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司，DHG-9071 A）、垂直洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，SW-CJ-2 FD）、电热恒温隔水式培养箱 （黄石市恒丰医疗器械有限公司，SGSP-02）、恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司，QYC-200）、数显三用恒温水槽（上海浦东物理光学仪器厂，HH-W 420）、数字酸度计（郑州宝晶电子科技有限公司，PHS-3 C）。

1.2 菌种活化及菌悬液的制备[14]将所有供测试的细菌分别接种于LB固体斜面培养基上，细菌置37℃恒温培养箱培养24 h，连续传代2次。将上述活化好的各菌种用生理盐水将其稀释成含菌量为106～107 CFU/mL的菌悬液备用。

1.3 LB平板培养基的制备[15]将配制好的LB 培养基高压蒸汽灭菌（121℃、20 min），冷却至50℃～60℃，无菌操作倾注于灭菌培养皿内，每培养皿装15～20 mL，低温保存备用。

1.4 原花青素溶液的制备 称取0.75 g OPC溶于3 mL无菌水中，漩涡混匀，并用无菌水稀释成所需浓度（250、200、150、100、50、25 mg/mL）备用。

1.5 抑菌试验方法[16]将吸水性强的滤纸片用打孔器制成直径为6 mm的圆形滤纸片。将滤纸高压灭菌后浸入无菌水、浓度为 250、200、150、100、50、25 mg/mL 的原花青素溶液中30 min，待其干燥后使用。并以庆大霉素和青霉素作为阳性对照。分别在LB培养基表面加入0.02 mL供试菌的菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀，15 min后用无菌镊子夹取滤纸片贴于涂菌平板上，于37℃恒温培养24 h，观察菌落生长情况，采用十字交叉法测定抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值（mm）为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。

1.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定[17]将高压灭菌后的滤纸片浸入通过二倍稀释法制备的浓度分别为25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mg/mL的松树皮原花青素水溶液中30 min，待其干燥后使用。以无菌水浸泡的滤纸片作为阴性对照，青霉素药敏纸片作为阳性对照，每组做3个平行试验。以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌种，使用1.2.4的方法测其抑菌圈直径，取其平均值。观察结果以无抑菌圈的最低溶液浓度为松树皮原花青素水溶液的最低抑菌浓度。

1.7 OPC稳定性研究

1.7.1 pH对OPC抑菌活性的影响[18]用1 mol/L HCl和NaOH溶液调节0.2 g/mL松树皮原花青素溶液的pH值分别为 2、4、6、7、8、10，以相应 pH 水溶液作为阴性对照，以青霉素药品作为阳性对照，无菌过滤，平衡24 h后以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌种，置37℃培养箱中培养24 h后测定抑菌圈直径大小，实验重复3次。

1.7.2 温度对OPC稳定性的影响[19]将0.2 g/mL OPC分别置于 20℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴条件下处理 1 h。无菌过滤后以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌种，置37℃培养箱中培养24 h后测定抑菌圈直径大小，实验重复3次。

1.7.3 紫外线对OPC稳定性的影响[20]将0.2 g/mL OPC 置于 40 w 紫外灯下分别照射 0、15、30、60、90、120 min。无菌过滤后以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌种，置37℃培养箱中培养24 h后测定抑菌圈直径大小，实验重复3次。

2 结果

2.1 OPC抑菌活性测定 由图1可知，OPC对革兰阳性有明显的抑制作用，而对革兰阴性菌无明显抑制效果。其中OPC对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强（P＜0.01），其次是对金黄色葡萄球菌的抑制作用（P＜0.01），而对大肠埃希菌和铜绿色假单胞菌无抑制作用。随着OPC的浓度增大其对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制效果也越显著，当OPC浓度达到200、250 mg/mL时，抑菌圈的大小基本一致。因此，选取枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为实验的菌种，浓度为200 mg/mL的OPC做后续的抑菌稳定性研究。

图1 不同药物浓度对各种菌的抑菌作用抑菌的内直径为0.6 cm，只有抑菌圈直径大于0.6 cm 才说明有抑菌作用Fig.1 Antimicrobial activity of different OPC concentrations on various bacteriaAntimicrobial inner diameter is 0.6 cm， only inhibition zone diameter that greater than 0.6 cm was described antimicrobial activity

2.2 OPC的最低抑菌浓度（MIC） 由图2可知，OPC对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为12.5，6.25 mg/ml。OPC对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度高于枯草芽孢杆菌，说明OPC对枯草芽孢杆菌的抑制作用比金黄色葡萄球菌强，抑菌效果明显。

图2 OPC最低抑菌浓度（MIC）Fig.2 The MIC of OPC against Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis

2.3 OPC稳定性研究

2.3.1 温度对OPC抑菌效果的研究 由图3可知，随温度上升，OPC对枯草杆菌的抑菌效果呈下降趋势，在60℃～80℃对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，说明温度对OPC的抑菌活性有一定的影响。但总体来说，OPC在20℃～100℃范围内处理1 h仍具有较好的抑菌效果，表明OPC具有热稳定性，OPC即使添加于需进行加热处理的药物中，也可稳定保持其抗菌防腐性能。

2.3.2 pH值对OPC抑菌效果的研究 由图4可知，pH对抑菌作用具有显著的影响，在pH＜6时，随pH值的升高，OPC对2种供试菌的抑菌能力显著升高。当pH＞7时，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌革兰阳性菌抑菌能力随pH的增加而显著下降。可见在偏中性pH值范围内，OPC具有较好的抑菌活性。pH升高或降低可能改变了OPC有效抑菌成分结构，而在中性的环境下OPC的结构较稳定，具有较强的抑菌活性。因此OPC作为防腐剂使用，应调节在中性环境中使其保持较强的抑菌活性。

图4 PH对药物抑菌作用的影响Fig.4 The antibacterial activity of OPC at different pH

2.3.1 紫外线对OPC抑菌效果的研究 以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，研究紫外照射对松树皮原花青素的抑菌活性的影响。由图5可以看出，经紫外线照射后OPC对两种菌仍有较好的抑制作用，抑菌效果变化不大，同时随照射时间的延长，抑菌效果相对较稳定。OPC在紫外线照射下对金黄色葡萄球菌的抑制作用相对较稳定，随紫外线照射时间的延长，照射90 min之后，抑菌作用基本保持不变；而对枯草芽孢杆菌则随时间的延长抑菌作用逐渐减弱，到90 min之后也基本保持不变。由此看出对于不同菌种，OPC的抑菌活性具有不同的紫外光稳定性，推测原因为OPC对不同菌种的抑菌机制存在差异。

图5 UV对药物抑菌作用的影响Fig.5 The impact of UV on the OPC antibacterial

3 讨论

本实验表明对枯草杆菌的抑制作用最强，其次是金黄色葡萄球菌，此外对革兰阴性菌大肠杆菌和绿脓杆菌没有抑菌及增菌作用。OPC药液浓度在150～250 mg/L范围内抑菌作用较强，OPC对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径可达12.2 mm、枯草杆菌达12.0 mm；OPC的抑菌活性均在接近中性条件下效更加稳定，经加热其抑菌效果变化不大，仍具有较高的抑菌活性。

原花青素是植物中普遍存在的生物类黄酮，在松树皮和葡萄籽中表达含量较高。与我们的研究结果相似，从苹果和葡萄籽中提取的原花青素对革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌和链球菌都有较强的抑制作用，但是温度、pH值和紫外线对原花青素抑菌作用的影响并未阐述[21]。本实验结果提示，松树皮提取的原花青素对革兰氏阴性菌-大肠杆菌和绿脓杆菌的抑制效果较小。但有研究表明，紫甘薯花青素对大肠杆菌的生长也有抑制作用[22]。我们分析从不同植物中提取的原花青素对于革兰氏阴性菌的抑制作用可能有不同。

总体上看，OPC抑菌活性较稳定，受环境因素影响较小， 即使经过食品加工中常见的热处理工艺，也可保持其良好的抑菌防腐性能。而且近年来研究报道原花青素具有抗氧化作用和清除自由基能力、保护心血管系统的功能、抗辐射作用等作用[23-25]，具有较高的应用价值。

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Study on bacteriostatic activity and stability of pine bark oligomeric proanthocyanidins

BAI Jing,YUAN Qing-shuang, LI Wei-lingΔ

(Department of Biotechnology, Biotechnology Department of Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

ObjectiveTo study the bacteriostatic activity and stability of pine bark oligomeric proanthocyanidins.MethodsBy the K-B disk diffusion method, spoilage bacteria as experiment strains, to study the inhibition effects of the pine bark oligomeric proanthocyanidins and the antimicrobial stability under certain temperature, pH, and UV exposure time.ResultsPine bark oligomeric proanthocyanidins had significant inhibitory effect on Gram positive bacteria (Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis), which had better inhibition effects in the media neutral, but temperature and UV had little influence on the antimicrobial effects. The minimum inhibitory concentration (MIC) of pine bark oligomeric proanthocyanidins against Staphylococcus aureus and Bacillus Sukatilis were 12.5 and 6.25 mg/mL, respective. However, on Gram negative bacteria(Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) there was no obvious inhibition effects.ConclusionThe pine bark oligomeric proanthocyanidins has significant inhibitory effect on Gram positive bacteria, the inhibitory effect is stronger in the range of pH 6-7 , and the temperature and UV had a little effect on its antibacterial action, which means that the antibacterial action of pine bark oligomeric proanthocyanidins had good stability.

pine bark oligomeric proanthocyanidins; disk diffusion method;bacteriostatic activity;stability; gram negative; gram positive

Q 93

A

1005-1678(2014)02-0055-04

马尾松树皮提取物（pinus massoniana bark extract，PMBE）是从野生马尾松树皮中提取出来的一种多酚类物质，其主要成分是由单体、寡聚体和多聚体等天然黄酮组成的原花青素（oligomeric proantho cyanidins，OPC）[1-3]。具有抗氧化、清除自由基、抗炎及诱导肿瘤细胞的凋亡，被广泛用于保健食品、药物以及化妆品的生产[4-8]。1961年德国的Karl等从山楂新鲜果实的提取物中首次分离得到原花青素，之后人们又相继在葡萄、花生、银杏等植物中发现原花青素，松树皮也已被证实是原花青素的主要来源[9]。近年来，人们对多酚物质抑制人类病原微生物给予高度的关注。研究发现葡萄、苹果、啤酒花和中国绿茶中的多酚物质可以抑制牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生长[10]，葡萄酒和植物多酚可抑制幽门螺杆菌毒素并治疗由其导致的疾病[11]；五倍子(Galla Chinensis)多酚提取物对变异链球菌(Streptococcusmutans)有抑制作用[12]。由此可见，多酚类物质对致病微生物也有控制和影响作用[13]。因此本实验以松树皮原花青素为材料，研究了松树皮原花青素对一些常见微生物和病原菌（大肠埃希氏菌、铜绿色假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的抑菌作用及温度、pH值及紫外线对抑菌作用稳定性的影响。此研究为松树皮原花青素在抑菌方面开发提供理论依据，也为今后将松树皮原花青素开发成一种天然防腐剂提供实验参考数据。

白晶，女，本科，研究方向:生物技术，E-mail:435760865@qq.com；李炜玲，通信作者，女，博士，硕士生导师，研究方向：肿瘤药物化疗、肿瘤免疫医学，E-mail：liweiling 2006@hotmail.com。