中药复方益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中AGEs、RAGEs影响的实验研究

张文顺，石岩

（1. 辽宁中医药大学 研究生学院，辽宁 沈阳 110847；2. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

中药复方益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中AGEs、RAGEs影响的实验研究

张文顺1，石岩2Δ

（1. 辽宁中医药大学 研究生学院，辽宁 沈阳 110847；2. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

目的观察中药复方益糖康对糖尿病肾病大鼠肾皮质中晚期糖基化终末产物（advanced glyclation end-products，AGEs）及其受体的影响，探讨其对糖尿病肾病的防治作用机制。方法采用链脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）诱导大鼠糖尿病模型，观察8周时肾脏组织AGEs、RAGE mRNA及蛋白表达的变化，以及经中药复方益糖康干预后的变化。结果糖尿病大鼠8周时，模型大鼠肾脏组织中的AGEs含量显著高于空白组（P＜0．01），而中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠肾脏组织中AGEs含量较模型组显著下降（P＜0．01）；糖尿病肾病模型组大鼠肾脏组织中糖基化终末产物受体（receptor of advanced glyclation end-products，RAGE）mRNA表达水平较空白组显著升高（P＜0．01），而中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平较模型组显著下调（P＜0．01）。结论中药复方益糖康对糖尿病大鼠肾功能的保护作用，与其抑制AGEs/RAGE的激活有关。

糖尿病肾病；晚期糖基化终末产物；糖基化终末产物受体；益糖康

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 AGEs含量检测试剂盒，购自武汉优尔生科技股份有限公司。兔抗大鼠RAGE 多克隆抗体购自Cell Signaling。兔抗大鼠GAPDH抗体购自Santa Cruz，HRP标记羊抗兔IgG抗体购自Abcam。RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。引物由北京三博远志生物技术有限公司代为合成。

主要实验仪器：VERITI型PCR仪（BIO-RAD），电泳仪（EPS 300，北京六一），凝胶成像分析系统（Tanon-4200 SF，上海天能）。

1.2 糖尿病肾病大鼠模型的构建及分组 SPF级SD大鼠

70只，体重200±20 g。采用随机数字法将70只大鼠随机分为正常组和造模组。除正常组外，其余各组采用高脂高糖饲料联合小剂量STZ（42 mg/kg，bw）的方法复制糖尿病大鼠模型，72 h后尾静脉采血测血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L以上者确定为糖尿病大鼠模型模型复制成功。糖尿病模型成功后按照血糖将造模组大鼠随机分为5组，分别为模型组、中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组（予贝那普利）。2周后留取24 h尿，若达到下列条件则认为糖尿病肾病模型成立[6]：①空腹血糖持续≥16.7 mmol/L；②尿白蛋白排泄率＞20 μg/min；③尿量是正常量的150%。中药预防组和中药低剂量组按照正常成人剂量（g/Kg）的6.3倍给药，中药预防组自糖尿病造模成功开始即给药；中药高剂量组按照低剂量的3倍给药；西药组给药量按照正常成人给药量等效换算成年大鼠给药量，即0.9 mg/（Kg·d）。

1.3 指标检测

1.3.1 各组大鼠肾脏组织中AGEs含量检测 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组大鼠肾脏组织中AGEs含量。取各组大鼠肾脏皮质100 mg置于2 mL玻璃匀浆器中，加入1 mL冷的PBS缓冲液，于冰上进行匀浆，收集匀浆液于2 mL离心管中，4℃离心机中，2000 r/min，离心10 min，吸取上清液用于AGEs含量检测，检测方法严格按照试剂盒中说明书操作步骤进行。

1.3.2 各组大鼠肾脏组织中RAGE表达水平检测 采用Western-bloting方法对各组大鼠肾脏组织中RAGE表达水平进行检测。称取肾脏皮质100 mg，按照组织净重与裂解液1：10的比例加入蛋白提取试剂，并用玻璃匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后静置于冰上20 min，10000 r/min进行离心，离心15 min，分离上清液即为总蛋白备用。采用考马斯亮蓝法对各组总蛋白进行蛋白定量，每孔上样20 μg总蛋白进行电泳，半干转印法将蛋白转至 PVDF 膜，一抗（1∶500）4℃孵育过夜、二抗（1∶1000）室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，用吸水纸吸干PVDF膜上的残液，加ECL发光液1 mL，置于凝胶成像分析系统中采集图像，并测定目的蛋白条带和内参条带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参条带灰度值比值作为统计数据，进行RAGE表达水平分析。

1.3.3 各组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平检测 采用RT-P C R方法对各组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平进行检测：RAGE上游引：5’-GGCCTTCCTCGGCGCAGAC-3’；下游引物：5’-TAGA TGCCCTCATCCTCATGC-3’，扩增片段长度 260 bp。内参β-actin上游引物：5’-CGTAAAGACCTCTATGC CAA-3’；下游引物：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，扩增片段长度349 bp。凝胶成像分析系统采集图像，并测定目的基因条带和内参基因条带的积分光密度值，以目的条带积分光密度值/内参基因积分光密度值的比值作为统计数据，进行RAGE mRNA表达水平分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0软件对各组数据进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，并采用单因素方差分析数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益糖康对糖尿病大鼠肾脏组织中AGEs含量影响 糖尿病肾病模型大鼠肾脏组织中的AGEs含量为（763.75±47.34）ng/g 组织，显著高于空白组（P＜0.01）；与模型组比较，中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠肾脏组织中AGEs含量均显著下降（P＜0.01，见表1）。

表1 大鼠肾脏组织中AGEs含量测定Tab.1 Measurement of AGEs content in rat kidney

*P＜0.01，与空白组比较，compared with blank group；﹟P＜0.01，与模型组比较，compared with model group；△P＜0.01，与西药组比较，compared with western medicine group。

2.2 益糖康对糖尿病大鼠肾脏组织中RAGE mRNA及蛋白表达影响 与空白组比较，DN模型组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平显著下调（P＜0.01，见图1、图2）。

图1 益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平影响**P＜0.01，与空白组相比；＃＃P＜0.01，模型组相比；△△P＜0.01，与西药组相比Fig.1 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathy**P＜0.01，compared with blank group；＃＃P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

图2 益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中RAGE mRNA表达水平的影响M. marker；1. 空白组；2. 模型组；3. 中药预防组；4. 中药低剂量组；5. 中药高剂量组；6. 西药组Fig.2 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathyM. marker；1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

2.3 益糖康对糖尿病大鼠肾脏组织中RAGE蛋白表达影响 与空白组比较，DN模型组大鼠肾脏组织中RAGE表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药预防组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠肾脏组织中RAGE表达水平显著下调（P＜0.01，见图 3、图 4）。

图3 益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中RAGE蛋白表达水平影响*P＜0.05，**P＜0.01与空白组相比；＃＃P＜0.01，模型组相比；△△P＜0.01，与西药组相比Fig.3 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE in rats with diabetic nephropathy*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank group；＃＃P＜0.01， compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

图4 益糖康对DN模型大鼠肾脏组织中RAGE蛋白表达水平的影响1. 空白组；2. 模型组；3. 中药预防组；4. 中药低剂量组；5. 中药高剂量组；6. 西药组Fig.4 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE in rats with diabetic nephropathy1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

3 讨论

DN的病理学改变包括肾小球肥大、系膜基质增生，肾小球基底膜增厚以及最终发生的肾小球硬化。AGE是糖尿病时许多组织蛋白质、氨基酸、脂质或核酸等大分子物质的游离氨基在无酶参与条件下与还原糖的醛基或酮基反应而产生的一种稳定的化合物。其在糖尿病肾病的发病机制中起着重要作用，是引起肾脏直接损伤以及通过RAGE信号通路而引起肾脏病变的主要物质基础[7]。糖尿病慢性并发症的关键因素是由于AGEs及其前体物质的蓄积，而肾脏的AGEs及其前体物质又直接引起肾小球毛细血管结构、功能的改变[8]，参与了DN的发生发展。AGEs与细胞表面的RAGE结合后，激活RAGE并作为信号转导受体激活细胞内各种信号转导通路，从而导致了细胞功能紊乱，使肾小球产生各种细胞外基质成分，引起肾脏组织增生，导致肾小球的硬化[9-11]。

许惠琴等[12]通过研究山茱萸环烯醚萜苷，发现下调糖尿病血管病变大鼠肾组织RAGE及TGF-βmRNA的表达，能够保护血管内皮，进而抗肾小球内基质的增生及基底膜增厚等作用。马建等[13-15]通过实验研究，降低肾组织AGES含量，抑制TGF-β 1、RAGEs mRNA、RAGE的表达，可以改善DN肾脏基质增生、系膜区增宽的病理结构，减轻肾小球硬化，改善肾功能，对DN起到治疗作用。

本研究发现，糖尿病肾病大鼠模型肾皮质中均有AGEs生成，尤以模型组最为显著，且各给药组对糖尿病肾病大鼠的肾皮质中AGEs含量具有显著下调的作用，与模型组比较(P＜0.01)。通过本实验观察，不同浓度的复方益糖康可显著下调肾脏组织中RAGE的mRNA及RAGE蛋白表达水平，与模型组比较(P＜0.01)；中药高剂量组与西药组比较无显著差异，中药预防组与西药组比较(P＜0.01)。说明益糖康可能通过抑制AGEs/RAGE的激活，从而调节肾血流量，有保护血管内皮，抗肾小球内基质增生而起到改善或延缓糖尿病时肾脏病变的发生和发展的作用，这可能是中药复方益糖康防治糖尿病肾病的作用机制之一。

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The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal AGEs and RAGEs in rats with diabetic nephropathy

ZHANG Wen-shun1，SHI Yan2Δ
( 1. Graduate School, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China；2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847, China)

ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal compound Yitangkang on the expressions of advanced glyclation endproducts (AGEs) and the receptor of advanced glyclation end-products mRNA(RAGE-mRNA) in rats with diabetic nephropathy(DN)，and to discuss the mechanism of the formulas in the treatment of DN.MethodsThe rat model of DN were established by intraperitoneal injection of strepotozotocin(STZ). After 8 weeks intervention with medications, the expression of renal RAGEs mRNA was detected by Real-time PCR, renal RAGE by immunohistochemistry, and renal content of AGEs by spectrophotometry.ResultsCompared with normal control group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in diabetic nephropathy rats were increased significantly(P＜0.01). Compared with DN group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in three doses Yitangkang groups and western medicine group were decreased significantly(P＜0.01).ConclusionChinese herbal compound Yitangkang could protect kidney of diabetic nephropathy rats,and the mechanism is related to its loweirng renal expression of RAGEs mRNA, RAGEs and AGEs content.

diabetic nephropathy; advanced glyclation end-products; receptor of advanced glyclation end-products; Yitangkang

R 285．5

A

1005-1678(2014)02-0045-03

随着糖尿病患病率的不断增高，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）发病率也呈现出逐年上升趋势。DN的发病机制是多种因子相互作用的过程，其中晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)在糖尿病肾病的发生与进展中起重要作用[1]，另有报道AGE与AGE受体蛋白（RAGE）的结合是通过促进ROS的合成从而导致了成纤维细胞和神经元细胞的凋亡[2]，进而引发糖尿病肾病。中药复方“益糖康”是以国家中药保护品种“降糖丹”为基础研制的，其治疗糖尿病经过多年的临床应用，取得了令人满意的疗效[3-5]，故本实验利用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病大鼠模型，观察中药复方益糖康对肾脏组织中AGEs及其受体的调控，进一步探讨其对糖尿病肾病的防治作用机制。

辽宁省科技计划项目（2011408004）

张文顺，男，博士，讲师，研究方向：糖尿病临床与实验研究，E-mail：wenshunzhang@163.com；石岩，通信作者，男，博士，教授，研究方向：糖尿病临床与实验研究，E-mail：shiyan@lnutcm.edu.cn。