蓝藻素经Nrf 2/HO-1发挥对阿霉素心肌损伤大鼠的保护作用

罗湘玉，罗卫民，郑雪松，张军

（湖北医药学院附属太和医院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

蓝藻素经Nrf 2/HO-1发挥对阿霉素心肌损伤大鼠的保护作用

罗湘玉，罗卫民Δ，郑雪松，张军

（湖北医药学院附属太和医院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

目的观察血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）在藻蓝素（C-phycocyanin，CPC）对阿霉素（Doxorubicin，DOX）致大鼠心肌毒性的保护作用中的作用。方法60只SD大鼠随机分为空白对照组（n=15）、DOX组（n=15）和CPC干预组（n=15）及HO-1抑制剂锡原卟啉Ⅸ（tin protoporphyrin IX，SnPP）组（n=15）。空白对照组仅给予等体积生理盐水，模型组采用DOX腹腔注射，使其2周内累计剂量达15 mg/kg。CPC干预组在模型组基础上腹腔注射浓度为20、40、60 mg/kg 的CPC。处理结束后，比色法测定血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性，同时测量心肌组织HO-1和caspase-3的活性；Western blot检测心肌组织中HO-1的表达以及Nrf2的激活。结果与对照组相比，DOX组小鼠血清中CK、LDH和caspase-3活性显著增高（P＜0．05），而心肌组织中HO-1活性仅轻度增高。CPC处理可明显抑制阿霉素心肌损伤大鼠中CK、LDH和caspase-3活性，并显著上调HO-1活性及蛋白表达水平。而SnPP处理后，与CPC组相比，大鼠血清CK、LDH以及caspase-3活性显著降低。此外，CPC明显促进核转录因子Nrf2的激活。结论CPC对阿霉素心肌损伤大鼠的保护机制可能是通过激活Nrf2并诱导HO-1表达有关。

蓝藻素；阿霉素；血红素氧合酶1

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 DOX购自意大利Pharmacia公司（批号：8 NB 002-A），CPC为Sigma-Aldrich产品（纯度均98%）。血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒为Stanbio产品。心肌caspase-3的比色测定试剂盒购自Quantikine。HO-1，Nrf2以及TATA盒结合蛋白（TATA binding protein，TBP）多克隆抗体购自Santa Cruz。SnPP和其他分析纯试剂主要购自Sigma-Aldrich公司。主要实验仪器：酶标仪（iMark，BIORAD），离心机（5418，Eppendorf），半干转印仪（Trans-Blot，Bio-Rad）

1.2 实验分组 成年雄性Wistar大鼠由湖北医药学院实验动物部提供（合格证号：13061015），体重（250±5）g，在 SPF环境下给予标准实验室的水和食物饲养2周。大鼠随机分成4组（每组15只），如下：组1为对照组，大鼠接受等体积的生理盐水作为阴性对照；组2为DOX组，大鼠连续2周每间隔48 h注射 DOX（2.5 mg/kg，ip.）共6次，使其累积剂量达15 mg/kg。组3为CPC治疗组，在组2的基础上，大鼠每日给予CPC（20，40，60 mg/kg）灌胃， DOX停止后，持续CPC灌胃4周。组4为SnPP干预组，在组3基础上，给予20 μmol/kg SnPP腹腔注射，每周3次，持续时间同组3。

1.3 血清CK和LDH活性的测定 采用分光光度计在波长340 nm处测量CK-MB的吸光度。LDH的测量按照Stanbio公司提供的诊断试剂盒进行，计算血清总LDH的活性（U/L）。

1.4 心肌HO-1活性测定 将获取的心肌组织匀浆18000×g 4℃离心10 min，获取400 μL上清加到反应混合物中（含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸盐、0.2 U葡糖糖6磷酸盐-1脱氢酶、2 mg大鼠肝脏胞浆、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血红素）。反应在黑暗的环境中37℃孵育1 h后加入1mL氯仿终止反应。并在463 nm和530 nm双波长测吸光度值（胆红素吸光系数为40），以生成的胆红素量表示HO-1活性，单位为nmol/（mg protein·h），并计算其与对照组的相对值。

1.5 caspase-3活性测定 50 mg心肌组织加入0.8 mL pH 7.4的裂解缓冲液中制成匀浆。10000 g 4℃离心15 min。获取上清用于caspase-3测定。采用间接法测定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的发光基团pNA，随后在405 nm处用测量其吸光度，从而间接反应其活性。

1.6 Western blot检测HO-1表达以及Nrf2核转位 根据试剂盒（Pierce）提供的步骤提取心肌组织中的总蛋白和核蛋白，并测定其浓度。获取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分离的总蛋白或核蛋白随后转印至PVDF膜上（Millipore），并利用含有质量分数为5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入-抗、抗 HO-1（1∶500）、β-actin（1∶5000）、抗 Nrf 2（1∶1000），抗TBP（1∶1000）的抗体4℃孵育过夜。多次洗涤之后，加入HRP标记的二抗（1∶10000稀释）孵育膜1 h。ECL法（Amersham）发光、显影。

1.7 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，并采用单因素方差分析数据，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CPC对血清CK-MB和LDH水平的影响 与正常组相比，DOX可导致血清LDH和CK-MB增高（P＜0.01）；与DOX处理组相比，CPC可导致血清LDH和CK-MB水平显著降低（见表1），而SnPP处理组中LDH和CK-MB水平显著高于CPC组（P＜0.05），但与DOX组相比差异无统计学意义。

表1 CPC对血清CK和LDH水平的影响Tab.1 Effect of CPC on the concentration of CK and LDH

2.2 CPC对心肌HO-1活性的影响 DOX处理后，与对照组大鼠相比，心肌组织中HO-1酶活性轻微增高。而经60 mg/kg CPC处理后，HO-1酶活性显著增高。而同时用SnPP处理后，HO-1酶活性显著低于CPC组，但仍高于对照组（见图1）。

2.3 CPC对caspase-3活性的影响 DOX处理后，心肌组织中caspase-3活性增加了55%。同时经60 mg/kg CPC处理后，caspase-3活性有所降低，而SnPP处理能再次上调caspase-3的活性（见图2）。

图2 CPC对caspase-3活性的影响1. 阴性对照组；2. DOX组；3. DOX+60 mg/kg CPC组；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP组*P＜0.05，与对照组相比；﹟P＜0.05与DOX组相比；△P＞0.05，与 DOX+60 mg/kg CPC 组相比Fig.2 Effect of CPC on caspase-3 activity in myocardial tissues1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP group*P＜0.05，compared with control group；﹟P＜0.05，compared with DOX group group；△P＜0.05，compared with DOX+60 mg/kg CPC group

2.4 CPC对心肌组织中HO-1表达的影响 与对照组相比，DOX大鼠心肌组织中HO-1蛋白表达水平有轻微增高，而经CPC处理后，HO-1表达进一步增强（见图3）。SnPP处理能再次降低HO-1的表达。而内参β-actin含量保持一致。

图3 CPC对DOX心肌毒性大鼠HO-1表达的影响1. 阴性对照组；2. DOX组；3. DOX+60 mg/kg CPC组；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP组Fig.3 Effect of CPC on HO-1 expression in DOX-induced myocardial injury rats1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group；4. DOX+60 mg/kg CPC+SnPP group

2.5 CPC对转录因子Nrf2活化的影响 Westernblot结果显示，DOX大鼠心肌组织内细胞核中Nrf2含量与对照组相比增高不明显，而CPC处理后，Nrf2转位水平显著增多，而核内参TBP含量始终维持不变。表明CPC能促进Nrf2从细胞浆转移至细胞核中（见图4）。

图4 CPC对DOX心肌毒性大鼠Nrf2核转位的影响1. 阴性对照组；2. DOX组；3. DOX+60 mg/kg CPC组；Fig.4 Effect of CPC on Nrf 2 translocation in DOX-induced myocardial injury rats1. Control group；2. DOX group；3. DOX+60 mg/kg CPC group

3 讨论

DOX是一种是作用于DNA的蒽环类抗生素，它能够对DNA发生嵌入作用，在临床中应用广泛。阿霉素的急性副作用包括恶心、呕吐和心律不整。长期使用后，在线粒体氧化磷酸化作用下，阿霉素和铁相互作用产生大量活性氧，可以破坏心肌，造成肌原纤维损伤或凋亡[6-7]。HO-1是催化血红素降解为CO、亚铁离子和胆红素的限速酶，并在机体的抗炎症、抗氧化损伤中发挥重要作用[8]，本研究显示，DOX毒性大鼠经CPC处理后，可显著上调HO-1的酶活性以及其蛋白表达。HO-1基因的启动子区域含有转录因子Nrf2的结合位点，本研究也证实CPC能诱导Nrf2从细胞浆转位至细胞核，从而激活Nrf2诱导HO-1表达。

Nrf2是机体一种重要的获得性保护性核转录因子。在非激活情况下，Nrf2通过与抑制物keap1结合于细胞质内。当细胞受到外源性刺激时，Nrf2从keap1中分离出来，转移至细胞核内，从而与应激诱导性基因包括HO-1的启动子区域的抗氧化剂应答元件结合[9]。本研究发现CPC处理后，Nrf2转位增加，这与心肌组织中HO-1蛋白表达以及酶活性的趋势一致，表明CPC诱导HO-1的表达可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1发挥对细胞保护作用，主要通过它的3种产物——CO、胆红素和Fe2+而实现的。CO是一种类似于NO的重要神经递质。它通过自分泌或旁分泌的方式作用于效应的效应细胞，催化GTP生成cGMP。cGMP通过激活相应的蛋白激酶、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）或调节离子通道而发挥相应的生理功能[10]。胆红素也是一种比维生素E和维生素C还强的抗氧化剂，它不但可直接与自由基反应，同时也能结合单线态氧从而预防烃类的光氧化作用。Fe2+可以诱导铁蛋白的合成，后者可减少细胞内游离铁的蓄积而发挥保护作用，以此对抗ROS导致的细胞损伤[11-12]。为了进一步评价HO-1在CPC的保护效应中的作用，在干预过程中加入SnPP，对CPC的保护作用进行了分析。结果表明，DOX模型大鼠血清LDH和CK-MB显著增高，而经CPC处理后，这些心肌损伤指标显著降低。同时给予SnPP处理后，能显著逆转CPC的保护效应。这表明CPC是通过上调HO-1蛋白的表达并上调其酶活性，从而发挥对心肌细胞的保护作用。

DOX致心肌细胞损伤的机制很多，包括离子和自由基假说、代谢机制和凋亡机制。心肌细胞是终末分化细胞，多种抗肿瘤药物可引起其坏死或凋亡，从而引起心肌细胞减少而导致心脏收缩功能不足[13]。研究显示，DOX可通过内源性和外源性机制引起心肌细胞凋亡，最终激活下游caspase-3，6和7。一旦caspase被激活，细胞即进入凋亡执行阶段[14-15]。本研究发现，CPC可抑制DOX引发的caspase-3激活，而HO-1抑制剂SnPP处理后，caspase-3活性再次增高，这表明HO-1能在一定程度上削弱DOX的促凋亡效应，最终抑制DOX引起的心肌细胞凋亡、坏死及心肌纤维化。

综上所述，本研究认为CPC可以促进Nrf2核转位，从而诱导心肌组织内HO-1表达上调，增强其酶活性，进而通过HO-1对DOX导致的心肌细胞凋亡产生抑制作用。

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C-phycocyanin protects doxorubicin-induced myocardial cells injury by Nrf 2/heme oxygenase-1 pathway

LUO Xiang-yu, LUO Wei-minΔ, ZENG Xue-song, ZHANG Jun

(Department of Cardiothoracic Surgery，Hubei University of Medicine Affiliated Taihe hospital of Shiyan, Shiyan, 442000 China)

Objective To observe the role of heme oxygenase (HO)-1 on the protective effect of C-phycocyanin (CPC) on doxorubicin (DOX)-induced myocardial cells injury by Nvf2/HO-1 pathway.Methods60 SD rats were randomly divided into control group, DOX group, CPC group and tin protoporphyrin IX (SnPP, an inhibitor of HO-1) group,each had 15 rats. The control group was injected with normal saline injection，while the DOX group was administrated with doxorubicin by intraperitoneal injection in a cumulative dose of 15 mg/kg for two weeks. For the CPC rats, 20, 40 and 60 mg/kg of CPC was administrated. The level of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) were detected, and the activity of HO-1 and caspase-3 were also examined. Expression of HO-1 and activation of Nrf 2 were detected by Western blot.ResultsCompared with control group, serum levels of CK, LDH and Caspase-3 activity in DOX group were significantly increased（P＜0.05）, but HO-1 in cardiac muscle was only increased slightly. upregulation. Treatment with CPC could significantly ameliorated the CK, LDH and Caspase-3 activity, and markedly induce HO-1 expression and its activity. The reduction of CK, LDH and Caspase-3 activity by CPC could be reversed by treatment of the HO-1 inhibitor, SnPP. Furthermore, CPC sould also induce Nrf 2 activation.ConclusionThe protective effect of CPC on doxorubicin-induced myocardial cells in jury via Nrf 2 induced HO-1 HO-1 expression.

C-phycocyanin；Doxorubicin；heme oxygenase-1

R 453．9

A

1005-1678(2014)02-0030-04

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是一种广泛应用于肿瘤治疗的蒽环类抗生素，是临床上最有效的抗肿瘤药物之一。尽管其对包括白血病在内的多种恶性肿瘤具有抑制作用，但其蓄积性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX导致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）、钙超载以及线粒体损伤介导的心肌细胞凋亡是其重要机制[2]。近年来，某些药用植物在DOX所致的心肌细胞损伤中发挥重要作用[3]，如上调血红素氧合酶（Heme oxygenase-1，HO-1）的表达，从而发挥抗氧化、抗凋亡等作用。藻蓝素（C-phycocyanin，CPC）一种从螺旋藻提取、加工而成的天然食用色素，是一种营养价值极高的营养物质。并具有强大的抗氧化和清除自由基能力[4-5]。本课题组的前期研究结果显示，CPC对DOX诱发的心脏毒性具有一定的保护作用，但其机制尚未明了。本研究旨在观察HO-1在CPC心肌保护作用中的作用。

十堰市科技攻关项目（2009S48）

罗湘玉，女，副主任护师，研究方向：心肺疾病的防治研究，E-mail：xiangyu_luo@126.com；罗卫民，通信作者,男，硕士，主治医师，研究方向：胸心外科疾病的诊断与治疗，E-mail:weiminluo@163.com。