CIP2A在非小细胞肺癌的表达及患者预后分析

高亚维，哈敏文

（1.辽宁医学院附属第一医院 肿瘤科，辽宁 锦州 121000；2.辽宁抚顺市传染病医院 三疗区，辽宁 抚顺 113015）

CIP2A在非小细胞肺癌的表达及患者预后分析

高亚维1，哈敏文2Δ

（1.辽宁医学院附属第一医院 肿瘤科，辽宁 锦州 121000；2.辽宁抚顺市传染病医院 三疗区，辽宁 抚顺 113015）

目的研究蛋白磷酸酶2A的抑癌因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的差异表达情况及探讨其临床意义及潜在的预后价值。方法应用免疫组织化学和实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测60例NSCLC癌组织及其癌旁正常组织2组中CIP2A表达情况，通过检测CIP2AmRNA及蛋白的表达情况，并分析其与临床病理资料和预后因素的关系。结果CIP2A mRNA肺癌组织比癌旁组织高表达（P＜0.01）；CIP2A的蛋白在癌组织中的表达明显高于对应的癌旁组织（P＜0.01）。CIP2A的表达水平与非小细胞肺癌组织的分化程度及淋巴转移有关（P＜0.05），而与性别、年龄、组织学分级、肿瘤大小、TNM（tumor nodemetastasis）分期无关。结论CIP2A在非小细胞肺癌组织中高表达，且随着非小细胞肺癌组织分化程度的增高及伴有淋巴结转移而增高。CIP2A及淋巴结转移情况是预后的独立危险因素。

非小细胞肺癌；蛋白磷酸酶2A的抑癌因子；实时定量；免疫组织化学

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：60例非小细胞肺癌标本和对应的癌旁组织收集于2008年～2014年在辽宁医学院进行治疗的NSCLC患者。所有患者术前均未行放疗和化疗，并经过病理确诊。其中男性51例，女性9例，年龄27～83岁。TNM（topography lymph nodemetastasis，TNM）分期标准依据2002年美国联合癌症分类委员会（American joint committee on cancer classification，AJCC）和国际抗癌联盟制定标准。本组病例9例失访，随访率为85%，随访开始时间为2008年6月，生存时间计算以月为单位，随访时间：手术日期到随访截止日期（2014年1月为止）或肺癌复发或转移而死亡的日期，最短随访时间为0.5个月，最长随访日期为66个月。完全失访病例和非肿瘤原因死亡病例按统计学要求以截尾数据处理。

1.1.2 材料：提取 RNA Trizol、氯仿、异丙醇及无水酒精，Tip-5和β-actin基因的引物等购于中国沈阳立信生物技术有限公司，逆转录生成cDNA的试剂盒由大连TAKARA生物公司生产，2步法real-time PCR试剂盒及提取RNA试剂盒均购自大连TAKARA生物公司，兔抗人CIP2A多克隆抗体（英国Abcam，稀释浓度1∶200）及S-P免疫组化试剂盒（2步法抗兔／鼠通用型免疫组化试剂盒，福州迈新）购于北京中杉生物技术有限公司，DAB溶液PBS（PH＝7.4）购于福州迈新生物科技有限公司；RM2135切片机产自Leica公司，BX51显微镜照相机及产自Olympus公司，电热恒温水浴箱CS501产自重庆实验设备厂，医用微波炉干燥箱产自上海实验仪器总厂。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR检测CIP2A mRNA表达：提取癌和癌旁组织总RNA均参照试剂盒说明，在Real Time-System TP800系统上行纯度检测，然后通过逆转录合成cDNA（反应体系25μL）。将剩余的总 RNA存于-70℃冰箱待用。按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000 4个浓度梯度对cDNA进行稀释，以β-Actin在4个浓度梯度下进行对照，分别测得4个不同的Ct值，观察标准曲线的线性关系是否可行。CIP2A cDNA的表达高低的判断标准：通过2（-ΔΔCT）方法，界定值：2（-ΔΔCT）值 ＞1.0视为高表达，＜1.0视为低表达。

1.2.2 免疫组化法检测CIP2A表达：48例NSCLC及癌旁正常组织先经甲醛溶液固定，然后使用石蜡包埋，采用连续切片的方法，确保每片厚为4μm。再进过高温抗原修复程序，并使用PBS反复冲洗3次（5min），使用50μL的一抗滴加在每张切片上，在40℃的冰箱孵育过夜，取出后再使用PBS冲洗3次，每次时长5min，在使用50μL的二抗滴加，再次放到室温孵育30min，取出后使用PBS冲洗3次，每次时长5min，DAB显色后使用中性树胶进行封片，阴性对照为PBS代替一抗。结果确定标准：光镜下每张切片选取癌细胞较多的10个高倍视野计数100个癌细胞中的阳性细胞数，无阳性细胞为“-”，阳性细胞数小于等于5%为“＋”，阳性细胞数在6%至20%区间的为“＋＋”，阳性细胞数大于20%为“＋＋＋”，其中“＋”和“－”视为低表达，“＋＋”视为中表达，“＋＋＋”视为高表达。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行分析，配对样本采用t检验；计数资料采用χ2检验；Log-rank检验判断差异性，生存分析采用K-M法。COX回归模型进行多因素分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线 目的基因CIP2A标准曲线其相关系数为0.999 84、管家基因β-Actin标准曲线其相关系数为0.999 67（如图1、图2）。CIP2A与 β-Actin M值分别为-3.254、-3.347，2组间M值之差的绝对值小于0.1。溶解曲线：其峰值单一，说明cDNA纯度高（如图3），扩增曲线起峰说明基因具有扩增（如图4）。

图1 癌组织目的基因CIP2A Fig.1 Carcinoma target gene CIP2A

图2 癌组织中的内参基因β-actin Fig.2 Carcinoma reference geneβ-actin

图3 溶解曲线Fig.3 Melting curve

图4 扩增曲线Fig.4 Amplification curve

2.2 不同组织中CIP2A的mRNA表达水平 CIP2A的mRNA在癌组织中的表达高于癌旁组织（P＜0.01，见图5）；癌组织中高表达CIP2A例数为48例，占80.00%。

图5 CIP2A在NSCLC组织中的表达Fig.5 Expression of CIP2A in NSCLC tissues

2.3 不同组织中CIP2A蛋白表达 48例非小细胞肺癌癌组织中高表达12例，中表达12例，低表达12例，癌旁正常组织12例无表达。CIP2A蛋白定位在肿瘤细胞的细胞浆，CIP2A的蛋白在癌组织中的表达显著高于对应的癌旁组织（P＜0.01，见图6）。

图6 CIP2A在癌及其癌旁正常组织中的表达（×400）Fig.6 Expression of CIP2A in NSCLC and paraneoplastic normal（×400）

2.4 CIP2A mRNA在非小细胞肺癌中的表达和临床病理特征的关系 CIP2A mRNA在NSCLC中的表达水平在肿瘤大小、年龄、组织学分级、性别、TNM分期间差异无统计学意义；在淋巴结转移情况、肿瘤细胞的分化程度间差异具有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 CIP2A mRNA表达水平在NSCLC患者临床病理指标间的关系Tab.1 Relationship between the expression of CIP2A and clinicopathological characteristics of NSCLC patients

2.5 CIP2A mRNA的表达水平与NSCLC预后 通过K-M生存分析及Log-rank检验发现CIP2A mRNA高表达组的5年生存率显著低于CIP2A mRNA低表达组（P＜0.05，见图7）。

临床病理指标包括：性别、年龄、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤细胞分化。单因素分析显示：CIP2A、肿瘤大小和淋巴结转移情况均影响预后（P＜0.05）。

图7 CIP2A mRNA的表达水平与NSCLC患者K-M生存曲线Fig.7 Kaplan-Meier survival curve of the expression of CIP2A in 60 patientswith NSCLC

3 讨论

本研究发现CIP2AmRNA在NSCLC中的表达水平与肿瘤大小、年龄、组织学分级、性别、TNM分期等因素差异无统计学意义；与是否伴有淋巴结转移、肿瘤细胞的分化程度等因素差异具有统计学意义（P＜0.05）。60例NSCLC患者中CIP2A mRNA呈现高表达水平其患者的预后较差，多因素分析显示CIP2A表达水平和是否伴有淋巴结转移是影响生存率的独立预后因素（P＜0.05）。Ckelman等［12-13］对29例 NSCLC癌组织中 CIP2AmRNA的表达进行检测，结果发现其中24例当中CIP2A的表达显著增高，而在正常组织中无表达或低表达。进一步从基因水平上研究发现，CIP2A基因表达与CMYC基因表达有关，这与本研究结果相似。另外，应用免疫组织化学方法对90例NSCL患者癌组织中CIP2A蛋白进行检测，结果显示阳性表达65例，阳性表达率72.2%，通过追踪随访发现CIP2A高表达者预后差。检测CIP2A在肺癌患者组织中的表达水平可作为判断预后的一个重要项目。Janssens等［14-15］采用相同的方法对60例肺癌术后患者的癌组织以及对应正常癌旁组织进行了CIP2A表达情况的检测，结果显示在癌组织中CIP2A高表达有38例，高表达率为63.3%，而CIP2A在正常癌旁组织中低表达或阴性表达。大量的研究证明显示CIP2A在肺癌组织中呈高表达，其表达水平与肺癌患者病情的严重程度及预后有很大关系，与本研究结果一致。目前，肿瘤治疗仍是临床治疗中所面临的重大挑战，随着分子靶向治疗的应用，如何进一步提高患者的生存率，找到针对CIP2A进行抗肿瘤治疗的有效药物，更为有效的联合用药和治疗方案仍需继续探索。

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（编校：李璐璐）

Analysis of CIP2A expression and prognosis in non-small cell lung cancer patients

GAO Ya-wei1，HA Min-wen2Δ

（1.Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.The Third Ward，The Municipal Infectious Hospital of Fushun，Fushun 113015，China）

ObjectiveTo study the different expressions of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A（CIP2A）in non-small cell lung cancer（NSCLC），investigate its clinical significance and potential prognostic value.MethodsImmunohistochemical and real-time polymerase chain reaction（PCR）were used to detect the expressions of CIP2A mRNA and protein in two groups of sixty paired NSCLC specimens and adjacent non-cancer tissues.The relationship between its expression and clinical pathological data and prognostic factors were analysed.ResultsThe expression of CIP2A mRNA in NSCLC specimenswas higher than those in adjacent non-cancer tissues（P＜0.01）；The expression of CIP2A protein in NSCLC tissueswas significantly higher than that in the corresponding adjacent non-cancer tissues（P＜0.01）.The expression of CIP2A was closely correlated with the differentiation and lymph nodemetastasis of NSCLC tissues（P＜0.05），while incorrelated with sex，age，pathematology type，tumor size and tumor nodemetastasis（TNM）stage.ConclusionCIP2A highly expresses in NSCLC，and the expression of CIP2A will increase with the differentiation and lymph nodemetastasis of NSCLC tissues.The expression of CIP2A and lymph nodemetastasis can be used as an independent risk factor for the prognosis of patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer；cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A；real-time；immunohistochemistry

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0081－04

肺癌是目前全球癌症死亡的首要原因，非小细胞肺癌约占全部肺癌的80%。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）恶性程度高，预后差，故研究其预后因素，对于判断预后、指导合理的临床治疗、提高生存率非常重要。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是能够抑制肿瘤的蛋白磷酸酶，2002年Hoo等［1］发现PP2A在胃癌组织和肝癌组织中的表达高于癌旁正常组织，随后命名蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A），它能够抑制PP2A的生物活性。全酶在细胞中的定位由结构亚基、调节亚基B和催化亚基C组成［2］，A亚基为支架作用；B亚基决定其底物专一性，C亚基具有催化活性。这决定了PP2A在多种生理活动中起到很大作用［3］。PP2A是一种肿瘤抑制因子［4-6］，其活性的抑制被认为是细胞转化的前提条件［7］，但是相关机制尚不清楚。CIP2A是与PP2A具有相互作用的内源性蛋白，它能够识别癌细胞中与PP2A相互作用的蛋白，相关文献报道提示CIP2A在恶性肿瘤的发生、发展中起到至关重要的作用［8-11］。本研究通过real-time PCR和免疫组织化学方法检测60例NSCLC及癌旁正常组织中CIP2A mRNA及蛋白的表达水平，并分析CIP2A的表达水平和临床指标及预后的关系，从而得出CIP2A的表达水平与NSCLC发生发展的关系。

辽宁省科技计划项目（2012225019）

高亚维，女，本科，主治医师，研究方向：非小细胞肺癌的诊治，E-mail：gaoyawei_gyw＠163.com；哈敏文，通信作者，男，博士，主任医师，研究方向：肺癌的诊断化疗及靶向治疗，E-mail：haminwen＠163.com。