急性白血病病人XIAP和Caspase-3的表达及其临床意义

段翠翠，王庆国，王为光，鲍莹莹，张 纯

（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003）

白血病是一种血液系统恶性肿瘤，严重危害着人类的健康。我国白血病发病率为2.76／10万。在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性）［1］。它同实体肿瘤一样，肿瘤细胞的过度增殖和凋亡受抑制是其发生发展的重要机制［2］。凋亡抑制蛋白（IAP）是近年来新发现的一类蛋白家族，其可以对抗各种凋亡诱导因素的作用，抑制细胞凋亡，与肿瘤疾病的发生、发展关系密切。至今为止人类已经发现了8个IAP家族成员，研究发现它的抗凋亡能力远远超过于Bc1-2家族，在肿瘤疾病的发生机制中发挥着重要的作用［3］，而XIAP的生物学机制及结构是IAP家族中研究最为明确的凋亡抑制蛋白［4］，而且其在该家族中被认为是最强、最有效的Caspase抑制物。Caspase-3是重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡过程中处于中心地位，是细胞凋亡的主要效应因子［5，6］，Caspase-3被激活后能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及结构蛋白等诱导的细胞凋亡，在肿瘤的发生中起着重要的作用。本研究应用逆转录聚合酶链反应方法，检测AL患者及健康成人骨髓细胞中XIAP、Caspase-3 mRNA的表达，探讨XIAP及Caspase-3在AL发生、发展过程中的作用以及二者相关性，为临床诊疗与预后提供有价值的参考指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组（AL组）：AL患者50例均系在佳木斯大学附属第一医院血液科自2012-03～2013-06住院治疗患者，男24例，女26例，年龄18～74岁，中位年龄48岁。包括初治32例，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）10例，急性髓细胞白血病（AML）22例；复发18例，其中ALL7例，AML 11例，AL患者均接受两个正规疗程化疗后，以骨髓缓解率作为疗效的判断标准。以上病人的诊断及疗效标准均参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》［7］。

1.1.2 对照组（N组）：选取佳木斯大学附属第一医院门诊健康体检的成人共30例，男18例，女12例，年龄26～58岁，中位年龄47岁。

1.2 单个核细胞分离及总RNA提取

无菌操作采集白血病患者骨髓液2m L后肝素抗凝。用人淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque PREMIMU，密度为1.077g／m L，上海新睿生物科技有限公司）2m L，以2 000r／min离心15min，分离单个核细胞。然后应用PBS液洗涤5×106个单个核细胞，加入0.8mL Trizol液 （Invitrogen公司），混匀后在-80℃下保存。所有操作要严格按照Invitrogen公司的试剂盒的说明书进行，提取上述单个核细胞中的总RNA，RNA的完整性采用变性凝胶电泳检测，并使用Beckman DU640蛋白核酸分析仪进行RNA浓度和纯度（A260／A280的值在1.8～2.0）的检测。

1.3 逆转录、聚合酶链反应（RT-PCR）分析

1.3.1 逆转录PCR试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，Trizol试剂提取细胞总RNA，应用752型紫外分光光度计测定260nm的吸收值来确定RNA的含量，以OD260相当于40Lg RNA来计算RNA的产率，OD260在1.8～2.0时可以认为提取的RNA纯度很高。RT-PCR采用一步法，按操作手册进行。内参照β-action及PCR引物都是由上海生工生物技术有限公司提供的。RT-PCR反应条件：cDNA合成和预变性1个循环：39℃15min，94℃2min；PCR扩增35个循环：94℃15s，59℃30s，72℃1min，终延伸1个循环72℃10min。制备1.7%琼脂糖凝胶，取10μLPCR扩增产物进行电泳，在紫外灯下进行拍照，并采用天能全自动数码凝胶图像分析系统进行拍照并进行灰度扫描分析，通过比较电泳条带的光密度值，获得Caspase-3及XIAP m RNA的相对表达量，结果以均数±标准差（）表示。

1.3.2 引物的序列XIAP：XIAP上游引物：5'-CCGTGCGGTGCTTTAGTTGTC-3'，下 游 引 物：5'-ATGGCAGGGTTCCTCGGGTAT-3'，扩增产物的长度为301 bp；Caspase-3引物：上游5'TGTCGATGCAGCAAACCTCA 3'，下游5'TTTCAGCATGGCACAAAGCG 3'，扩增产物469 bp；以β-actin作为内参照，其上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，扩增产物的长度为205 bp。

1.3.3 PCR产物分析取10m L扩增产物与2μL 6×Loading Buffer混合后在1.7%琼脂糖凝胶中120V电泳30min。急性白血病初治组、和复发组及对照组在205bp和301bp处均可见一条亮带，分别为β-actin和XIAP m RNA；在469 bp处为Caspase-3 mRNA。应用紫外线透射仪观察并且拍照，经Metamorph ImagingSight软件进行分析并且读取光密度值，取XIAP mRNA／B-actin、Caspase-3 m RNA／β-actin光密度比值进行半定量分析，各标本重复3次，取平均值。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验。XIAP、Caspase-3的相关性采用Spearman等级相关进行相关分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 AL组XIAP及Caspase-3的表达

AL组病人与对照组病人均表达不同水平的XIAP及Caspase-3，见图1、图2。AL组XIAP的表达水平为（0.679±0.132），明显高于对照组（0.486±0.059），差异有统计学意义（P＜0.05）；AL组Caspase-3的表达水平为（0.178±0.057），明显高于对照组（0.369±0.062），差异有统计学意义 （P＜0.05）。两者呈负相关 （r=-0.837，P＜0.05）。而ALL与AML病人XIAP及Caspase-3表达水平差异无显著性 （P＞0.05）。

（M：Marker；1对照组；2、3：初治 AL组；4、5：复发 AL组）图1 XIAP基因RT-PCR检测

（M：Marker；1：对照；2、3：初治 AL；4、5：复发 AL）图2 Caspase-3基因RT-PCR 检测

2.2 XIAP和Caspase-3在初治AL组和复发AL组中的表达

XIAP在初治AL组的表达水平分别为（0.596±0.031），明显低于复发AL组（0.828±0.107）差异有统计学意义（P＜0.05）；Caspase-3在初治AL组的表达水平分别为（0.207±0.043），明显高于复发 AL组（0.126±0.039）差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 XIAP及Caspase-3的表达与患者临床疗效的关系

根据急性白血病初治组XIAP及Caspase-3的表达水平 （χ1=0.596；χ2=0.206）将其分为高、低表达组（XIAP／β-actin≥0.596为高表达，＜0.596为低表达；Caspase-3／β-actin≥0.206为高表达，＜0.206为低表达）。XIAP高表达组经过正规治疗两个疗程完全缓解率为26.7%（4／15），而XIAP低表达组完全缓解率为64.7%（11／17），两者比较差异有显著性（χ21=4.630，P＜0.05）；Caspase-3高表达组经过正规治疗两个疗程完全缓解率为68.8%（11／16），而Caspase-3低表达组完全缓解率为25.0%（4／16），两者比较差异有显著性 （χ22=6.149，P＜0.05）。

3 讨论

肿瘤细胞凋亡受抑在肿瘤的发生发展中发挥着极其重要的作用，研究发现不同的凋亡途径都是通过激活Caspase的完成的［8］。而Caspase-3被认为是Caspase级联反应中最为重要的效应酶，在凋亡途径最后的执行阶段常常起到不可替代的核心作用，其被称为凋亡的”执行者”［9］。鉴于Caspase-3在凋亡中发挥的关键作用，它已经成为了近几年凋亡研究的热点。

XIAP系分子结构研究得最清楚的凋亡抑制蛋白IAP家族的一员，它是内源性凋亡抑制蛋基因家族中最有效的Caspase抑制剂［11］，大量研究表明，XIAP在肿瘤细胞的表达水平显著高于正常组织，提示其过度表达可以抑制多种刺激诱导的细胞凋亡。研究发现XIAP可以通过其BIR2、BIR3分别抑制Caspase-3、Caspase-7的活性及Caspase-9的活性及环指结构域泛素降解Caspases等多种途径而发挥抗凋亡作用。

本研究证实，在急性白血病患者骨髓液中XIAP m RNA的表达明显高于正常对照组，caspase-3 mRNA的表达明显低于对照组，有统计学意义，说明二者在AL的发生发展中关系密切，二者可能是白血病细胞凋亡信号传导网络中的最重要的环节之一。并且发现XIAP和Caspase-3的表达具有负相关性，二者经Spearman相关分析显示r=-0.837，P＜0.05。AL初治组XIAP的表达水平低于复发组XIAP表达水平（P＜0.05）；AL初治组Caspase-3的表达水平高于复发组Caspase-3表达水平，而且XIAP高表达组经过两个正规疗程化疗后完全缓解（CR）率低于低表达组（P＜0.05），Caspase-3高表达组的完全缓解率高于低表达组（P＜0.05），提示二者的表达与化疗药物的敏感性有一定的联系，XIAP的高表达及Caspase-3低表达可能是导致急性白血病细胞对化疗药物不敏感的原因之一。实验中ALL组与AML组比较，XIAP、Caspase-3表达水平无统计学意义，提示XIAP、Caspase-3与AL患者的临床分型可能无关，这一结论尚有待于进一步扩大病例数继续研究。因此，XIAP、Caspase-3可能参与了急性白血病的发生发展，可为急性白血病的临床诊疗与预后提供有价值的参考指标。

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