血浆和支气管肺泡灌洗液中脂连素和TXB2、6-keto-PGF1α水平与急性肺损伤关系的研究

孙玉花，李来传，史有奎，臧全玲，陈京霞，李 凤，张秀文

（1.潍坊医学院，山东 潍坊261031；2.潍坊医学附属医院急诊科，山东 潍坊261031）

急性肺损伤是一种常见危重急症，每年的发病率一直稳步上升。据最新统计数据我国每年大约有1 200 000人患病，且医院病死率约40%～60%［1］。ALI的发病机制复杂，多数学者认为可能与炎症细胞（中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等）被激活以及内皮细胞受损而导致大量炎性介质及细胞因子生成和释放有关。脂连素（APN）是近年来发现的主要由脂肪细胞分泌的一种蛋白质激素，尽管APN最初被描述为胰岛素增敏剂，最近的研究已定义有多效性抗炎和血管保护作用［2，3］，且早有国外文献报道低脂连素血症可增加ALI发生的风险。此外，在小鼠的实验研究表明，APN有助于肺的免疫稳态［4］。根据APN的免疫和血管保护特性，其理论上可能用于治疗ALI。国内对于APN是否参与ALI发生发展过程的研究尚少，本研究通过测定正常对照组和ALI组大鼠的血浆和支气管肺泡灌洗液（BALF）在不同观察时期的APN水平的变化情况，观察其与ALI的关系，并对APN水平与ALI的程度是否存在相关性进行研究。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠共45只，购于潍坊医学院动物实验中心，饲养于干净、适温的实验室，正常饮食，并避免发生肺部感染。

1.1.2 实验药品

LPS：E.coli内毒素；氟烷；1%戊巴比妥。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理：将45只大鼠随机分成生理盐水对照组（9只）与实验组（36只）。用氟烷将大鼠麻醉并固定于操作台。用简易雾化器给予实验组气管内雾化吸入LPS 0.5m L／kg（用生理盐水配制LPS200μg／m L），对照组气管内雾化吸入生理盐水0.5m L／kg。然后将处理后的36只实验组动物再随机分成4组，每组9只进行观测，LPS给予后观察4h为4h组，观察12h为12h组，观察24h为24h组，观察48h为48h组。对照组观察24h。

1.2.2 观察实验动物和采集标本：在大鼠观察完毕时，给予各大鼠50mg／kg的1%戊巴比妥钠行腹腔麻醉。然后，暴露气管并开胸，观察肺形态。采集心脏血后，在左心耳开一约2mm切口，右室插入套管针，并于右室灌注肝素生理盐水冲洗肺血管床直至肺组织洁白。将左主支气管结扎后取左下肺组织（约1cm×1cm×0.5cm）用4%多聚甲醛浸泡固定24h，常规脱水、包埋、制成蜡块后用HE染色，用于光镜下观察。余下的左肺组织称湿重（W）后置60℃温箱，7d后称干重（D），求得湿重／干重比（W／D）。

1.2.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）留取及细胞计数：右肺用磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗8次，每次2.5m L，回收灌洗液。用单层纱布滤去黏液后取滤液10m L以3500rpm离心10min，吸取上清液保存于-20℃冰箱中待测细胞因子的含量及总蛋白的含量，离心后沉渣用于白细胞计数和中性粒细胞百分比的测定。

1.2.4 血浆和BALF中APN、TXB2、6-keto-PGF1α含量的测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ABC-ELISA）法分别检测各样本APN、TXB2、6-keto-PGF1α的含量水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计分析，各组数据均以（）表示。组间差异采用单因素方差分析，SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异显著。相关性分析采用直线相关回归分析。

2 结果

2.1 大鼠的体征指标

在观察时间内所有大鼠均存活。各组大鼠呼吸频率的差异无统计学意义。肺湿／干重表明，4～12h组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），24～48h组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 BALF细胞计数、分类及白蛋白含量

LPS给予后4～48h的各实验组BALF中性粒细胞数及白蛋白含量与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

表1 ALI大鼠不同时相湿／干重、BALF细胞总分数及白蛋白含量（，n=9）

表1 ALI大鼠不同时相湿／干重、BALF细胞总分数及白蛋白含量（，n=9）

注：符号相同组间无差异，P＞0.05；符号不同（＃、＊）组间有差异，P＜0.05。

组别 湿／干重 白蛋白（g／L） 细胞总数×106 巨噬细胞% 中性粒细胞% 淋巴细胞%.3 13.6±3.3 4h组 6.73±0.68＊ 0.53±0.16＊ 18.9±0.6＊ 6.3±1.2＊ 89.6±7.3＊ 4.1±1.4＊12h组 6.50±0.59＊ 0.59±0.15＊ 19.0±1.3＊ 6.8±3.2＊ 87.9±6.9＊ 5.6±2.5＊24h组 4.80±0.58 0.37±0.12＃ 17.8±1.4＊ 7.1±3.8＊ 88.3±10.7＊ 4.7±1.8＊48h组 4.70±0.75 0.31±0.05＃ 16.9±0.9 28.5±2.7＃ 64.2±8.2＃ 6.2±1.9对照组 4.48±0.37 0.15±0.03 14.1±1.2 79.2±4.2 7.3±2＃

2.3 肺组织病理改变

2.3.1 NS对照组：光镜下肺泡结构完整，无红细胞及中性粒细胞渗出（见图1）。

图1 对照组

2.3.2 4h组：大体观察可见肺组织肿胀，包膜光亮，约半数可见出血点。光镜（见图2）肺泡腔内有明显的中性粒细胞呈灶状浸润及红细胞少量渗出；肺泡壁弥漫性轻度水肿、增厚且肺间质轻度水肿，红细胞及淋巴细胞浸润；还可见不规则形的毛细血管扩张。

图2 4h组

2.3.3 12h组：大体与4 h组外观相似，光镜下（见图3）较4h组肺泡腔内红细胞渗出明显，纤维蛋白渗出几乎充满管腔，中性粒细胞大面积渗出，肺泡间隔明显增宽。

图3 12h组

2.3.4 24～48h组：大体观察可见肺组织略发黄，但无出血点。光镜（见图4）见肺泡腔内有泡质碎片，中性粒细胞浸润减少；肺泡腔扩大且肺泡壁薄厚不均；肺泡间质及成纤维细胞增生并有淋巴细胞、巨噬细胞浸润。毛细血管扩张少见，形态不规则。

图4 24～48h组

2.4 血浆和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α水平的变化

实验组中4h、12h组血浆和BALF中APN、6-keto-PGF1α水平低于正常对照组，且血浆中APN差异更显著（P＜0.01）；4h、12h组血浆和BALF中TXB2水平高于正常对照组 （P＜0.05）；24h、48h组中APN、TXB2及6-keto-PGF1α水平与对照组无差异（P＞0.05）。见表2。

表2 ALI大鼠不同时相血浆和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺损伤评分（，n=9）

表2 ALI大鼠不同时相血浆和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺损伤评分（，n=9）

注：符号相同组间无差异，P＞0.05；符号不同（＾、＊）组间有差异，P＜0.05，＃ 组与对照组相比差异显著，P＜0.01。

组别 肺损伤评分Serm APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）BALF APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）对照组 0.8±0.8 16.9±2.0 127.6±48.5 94.2±18.9 1.7±0.1 131.7±36.5 99.2±16.2 4h组 8.4±1.8 9.5±1.9＊＃ 187.7±61.2＊ 82.4±15.4 1.5±0.2 216.6±45.1＊＃ 88.8±14.6 12h组 11.6±1.9 8.3±1.2＊＃ 259.1±32.6＊＃ 80.9±10.3 1.4±0.2＊ 338.5±33.2＊＃ 85.7±10.2 24h组 3.9±2.0 15.1±1.8＾ 143.4±62.1＾ 85.1±11.9 1.5±0.3 147.3±49.2 90.1±11.9 48h组 4.9±2.4 15.2±1.2＾ 139.3±38.2＾88.4±14.8 1.6±0.3 145.3±21.5 93.4±14.5

2.5 相关性分析

BALF中APN水平与ALI评分不存在直接相关性，血浆中APN水平与ALI评分存在较高的负相关（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。

3 讨论

ALI的发生发展机制非常复杂，目前认为ALI是多种炎症介质相互作用的结果，且细胞因子之间相互联系、相互影响形成复杂的促炎介质及抗炎介质系统，两大炎症系统的相互作用形成更为复杂的“细胞因子网络”，当打破两大系统之间的平衡，则发生炎症介质失控性释放，导致ALI甚至多器官功能障碍综合征。

ALI时，创伤、感染等因素刺激血循环中出现高水平的β-肾上腺能激动剂、LPS、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，β-肾上腺能激动剂可抑制脂肪细胞中APN的mRNA水平且LPS、TNF-α能直接抑制脂肪细胞中APN mRNA的表达等，均可抑制APN分泌。APN分泌减少可通过降低细胞（内皮细胞）内腺苷酸环化酶的含量水平［5，6］影响游离脂肪酸的代谢导致血管内皮功能障碍、内皮细胞的损伤以及通过激活AMPK途径从而抑制 NF-k B途径的激活［7］的作用减弱，均可导致中性粒细胞聚集，造成各种炎症介质的大量释放，其中血小板和白细胞释放的血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）可强烈收缩血管、支气管平滑肌和诱导血小板聚集，引起血管、支气管痉挛和血管内广泛的微血栓形成，造成微循环障碍、组织缺氧坏死等病理性损害；此外，APN浓度降低引起内皮细胞的损伤导致PGI2的表达减少，当TXA2升高、PGI2降低，打破两者浓度平衡时，可引发血管收缩、血小板聚集及血栓形成等从而加重ALI。本实验通过测定ALI不同时相的血浆APN浓度，得出4h、12h组的APN浓度与对照组相比明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；血浆中TXB2的浓度与对照组相比明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），6-keto-PGF1α较对照组在相应时相表现出与APN浓度降低程度相一致的低表达浓度，李金玲等［8］所做的油酸致家兔急性肺损伤的结果与本结果一致。ALI时循环中APN水平的下降引起TXB2水平升高，具有拮抗它作用的6-keto-PGF1α的水平降低，TXB2／6-keto-PGF1α比例失衡，促炎反应与代偿性的抗炎反应平衡被破坏，造成对机体的损害。此实验结果与Jason M Konter［9］等所证实的低脂连素血症可增加急性肺损伤的风险这一理论相符合。ALI时肺作为主要的靶器官，肺泡毛细血管膜和肺泡上皮损害，肺毛细血管通透性增加，富含蛋白质的体液积聚于肺间质和肺泡内，导致肺水肿。早有 Miller M等［10］研究发现：气道内皮细胞也可分泌APN及表达APN功能性R1受体。虽然目前的研究主要集中在APN通过保护内皮细胞减弱LPS诱导的ALI，APN也可能通过其他非细胞机制介导抗炎作用。之前有国外报告APN已被证明在体外可结合LPS［11］。但是如果这个机制发挥了重大的作用，BALF中细胞因子水平的下降应该已经出现在4h后，这与本实验中4h组的BALF中TXB2水平升高相矛盾，且本研究中BALF中的APN浓度的水平变化对照组相比无统计学意义，我们可推测APN的非细胞抗炎作用并不是ALI调制作用的主要机制。此假设与Jason M Konter所研究的APN通过抑制内皮细胞活化减弱LPS诱导的急性肺损伤的实验调查结果相一致。本研究同时记录了大鼠的肺损伤评分，血浆中APN水平与肺损伤评分结果呈较高的负相关（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。BALF中APN含量则无相关性，进一步说明血浆APN水平能够反应肺损伤的程度。ALI的炎症反应过程是逐渐发展变化的，本研究利用小剂量LPS建立了轻型ALI模型［12］，以利于研究ALI的发生、发展甚至修复等一系列病理过程，可动态观察各个指标的变化，将有益于深入探讨APN在其中的作用。

综上所述，本研究表明APN参与了ALI的发生发展过程，且血浆APN水平可反映ALI程度。

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