Cyclin E/CDK2及p27在胃癌细胞周期G1/S调控中的研究

张桂东,尹清臣

(河北省邯郸市中心医院,河北 邯郸 056000)

胃癌是在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居消化道恶性肿瘤的首位。肿瘤的发生是多因素引起的，包括多种抑癌基因的失活和癌基因的激活，目前细胞周期与肿瘤的关系越来越受到人们的重视。Cyclin E/CDK2及p27可调控细胞周期G1向S过渡，已有学者报道Cyclin E/CDK2在细胞中表达增高可能引起肿瘤的发生[1-2]，但大多数研究是采用免疫组织化学方法进行检测，而在定量指标方面缺乏客观性。流式细胞术对细胞蛋白定量的检测具有快速、客观、准确的特点。本研究利用流式细胞术方法检测胃癌组织中Cyclin E/CDK2、p27蛋白表达及细胞增殖，探讨其与胃癌发生及发展关系，并对其相关性进行分析。现将研究结果报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 收集我院2010年1月—2011年6月胃癌手术切除标本，每例标本分别取癌组织及手术切缘正常胃组织(距癌边缘5 cm以上)。部分固定于10%中性甲醛溶液，石蜡包埋切片，HE染色进行病理诊断；部分固定于70%乙醇中用于流式细胞术检测。患者术前未经任何抗癌治疗。共选取60例胃腺癌及正常胃组织，其中男41例，女19例；年龄36～78岁，平均58.5岁，中位年龄60岁，>60岁25例，≤60岁35例。其中26例为高中分化腺癌，34例为低分化腺癌；侵袭至浆膜者有18例，侵袭至浆膜外者有42例；38例淋巴结转移，22例未转移。

1.2主要试剂 鼠抗人Cyclin E抗体(HE12)，美国Santa Cruz公司；兔抗人CDK2抗体(Thr 160)，美国Santa Cruz公司；鼠抗人P27抗体(F-8)，美国Santa Cruz公司；羊抗鼠FITC标记的IgG二抗，美国Jackson ImmunoResearch；羊抗兔FITC标记的IgG二抗，美国Jackson ImmunoResearch。

1.3检测方法 ①将临床上手术取下来的标本，经10%中性甲醛溶液，石蜡包埋切片，HE染色，由两名富有经验的病理医师进行病理诊断。②流式细胞术(FCM)检测。利用网搓法制备胃癌及正常胃组织的单细胞悬液,流式细胞术检测胃癌及正常胃组织细胞周期染色,用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，计算细胞周期各期的百分比，以流式细胞术一维直方图表示。细胞增殖状态以增殖指数(PI)表示，PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%。胃癌及正常胃组织细胞中Cyclin E、CDK2及p27蛋白的表达严格按照试剂盒的要求上机检测。在对免疫荧光标记物测定时，分别设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的同型对照。应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。流式细胞术检测Cyclin E、CDK2及p27蛋白表达量以平均荧光强度(MFI)表示。

2 结 果

2.1胃癌及正常胃组织细胞PI比较 胃癌组织及正常胃组织细胞增殖指数分别为(40.62±5.07)%和(24.99±3.11)%，胃癌组织细胞增殖指数显著高于正常胃组织(P<0.01)。

2.2胃癌及正常胃组织细胞中Cyclin E、CDK2、p27蛋白表达荧光强度比较 胃癌组织及正常胃组织细胞中Cyclin E蛋白表达荧光强度分别为(482.67±19.45)A.U.和(442.46±20.49)A.U.，CDK2蛋白表达荧光强度分别为(469.04±21.62)A.U.和(436.64±11.24)A.U.，p27蛋白表达荧光强度分别为(449.10±19.98)A.U.和(502.17±18.78)A.U.，胃癌组织与胃正常组织上述指标比较均有显著性差异(P均<0.01)。胃癌组织细胞中Cyclin E、CDK2及p27蛋白表达水平与不同临床病理特征关系见表1。

3 讨 论

表1 胃癌组织细胞中Cylin E、CDK2及p27蛋白表达水平(MFI)与不同临床病理特征的关系

目前，恶性肿瘤已成为威胁人们生命健康的主要疾病之一。恶性肿瘤的早期诊断及治疗对于患者的预后及生存期具有重要的意义。许多肿瘤患者就诊时已是中晚期，且多数已有远处转移，治疗预后差、生存期短。因此，恶性肿瘤患者早期诊断及治疗对于其生存及预后具有重大意义。恶性肿瘤发生过程中，从正常组织向癌变过程中，有细胞内部一些蛋白表达的异常，这些异常表达的蛋白调控细胞恶变过程，检测这些蛋白即肿瘤标志物，可以为恶性肿瘤早期诊断提供客观的检测指标。恶性肿瘤具有增殖旺盛的特点，考虑调控细胞周期的因素可能参与了恶性肿瘤的发生。本研究中利用流式细胞术的方法检测了不同胃病变组织中细胞周期情况，发现胃癌细胞增殖指数显著高于胃正常组织，表现出旺盛增殖的能力，这与目前研究的肿瘤具有增殖旺盛特点结果相一致。说明细胞周期的异常参与了胃癌的发生及发展。

Cyclin E 是调节细胞周期的主要因子，在细胞周期的各时相表达差异较大，在G1晚期和临近S期表达量达到高峰，当细胞进入分裂期后，Cyclin E 被迅速降解，因此，Cyclin E是调节细胞周期从G1期向S期过渡的关键因子[3]。CDK2是CDK家族成员之一，可与Cyclin E形成功能性复合物，促进细胞周期由G1向S期过渡。

调控G1期向S期过渡的Cyclin-CDK复合物对细胞周期进行起着关键性的作用，如其在细胞中异常表达，必然会影响细胞周期的顺利进行。体内细胞周期对于维持正常机体具有重要作用，肿瘤细胞具有无控性增殖且增殖旺盛的特点。肿瘤的发生与细胞周期的调控因素紊乱有关，调控G1期向S期过渡的Cyclin E-CDK2复合物异常表达与多种肿瘤的发生有关。张志伟等[4]研究显示，免疫组织化学方法检测Cyclin E在胃癌组织中的表达，发现Cyclin E蛋白主要在细胞核中表达，原发癌、淋巴结转移癌组织中Cyclin E 蛋白表达显著高于正常胃黏膜、癌旁和非典型增生胃组织。冯晓洁等[5]报道，免疫组织化学方法检测结果显示Cyclin E在恶性涎腺多形性腺瘤中的阳性表达率显著高于良性腺瘤，并且Cyclin E蛋白的表达与恶性肿瘤的浸润性相关。张桂珍[6]研究发现，Cyclin E在皮肤鳞状细胞癌中表达显著高于正常皮肤，且与肿瘤分化程度有关(采用免疫组织化学方法检测)。Jean-Francois等[7]研究显示，Cyclin E蛋白的高表达可能与白血病的发生有关。Rakitina等[8]研究显示，Cyclin E和CDK2的异常表达与大肠癌有关。本实验研究利用流式细胞术方法检测胃癌组织中Cyclin E/CDK2蛋白表达水平，探讨其与胃癌发生及发展的关系。结果显示，在胃癌组织中Cyclin E 及CDK2蛋白表达水平显著高于正常胃组织，Cyclin E 及CDK2蛋白表达量增高可以促进细胞周期从G1期向S期过渡使细胞呈现旺盛增殖能力，这与流式细胞术检测得到的细胞周期的结果相一致。而且胃癌组织中Cyclin E 及CDK2蛋白的表达量与细胞分化程度、肿瘤浸润性及转移有关，低分化、浸润至浆膜外、有淋巴结转移的胃癌细胞中Cyclin E 及CDK2蛋白的表达水平显著高于高中分化、浸润至浆膜、无淋巴结转移的胃癌，提示Cyclin E 及CDK2蛋白的高表达可能参与了胃癌的发展过程。 细胞周期素依赖性激酶抑制子主要包括INK4及Cip/Kip家族成员。INK4 家族包括p15，p16，p18和p19蛋白，特异与CDK4/6单体结合抑制Cyclin D的活性。而Cip/Kip家族包括p21，p27和p57蛋白，结合和灭活Cyclin-CDK 2复合物的异质二聚体[9]。p27蛋白主要抑制Cyclin E/CDK2和Cyclin D/CDK4等激酶复合物的活性。p27在细胞中低表达或表达缺失可引起肿瘤的发生[10-11]。本实验利用流式细胞术方法检测不同病变胃组织中p27蛋白的表达水平，结果显示，胃癌组织中p27蛋白表达水平显著低于胃正常组织，提示其异常表达可能参与了胃癌的早期发生。同时检测到p27蛋白的表达量与细胞分化程度、肿瘤浸润性及转移有关，低分化、浸润至浆膜外、有淋巴结转移的胃癌细胞中p27蛋白的表达水平显著低于高中分化、浸润至浆膜、无淋巴结转移的胃癌，提示p27蛋白的低表达可能参与了胃癌的发展过程。

[参考文献]

[1] Scuderi R,Palucka KA,Pokrovskaja K,et al. Cyclin E overexpression in relapsed adult acute lymphoblastic leukemias of B-cell lineage[J]. Blood，1996,87(8):3360-3367

[2] Akli S,Keyomarsi K. Cyclin E and its low molecular weight forms in human cancer and as targets for cancer therapy[J]. Cancer Biol Ther，2003,2(4 Suppl 1):S38-S47

[3] Siu KT,Rosner MR,Minella AC. An integrated view of cyclin E function and regulation[J]. Cell Cycle，2012,11(1):57-64

[4] 张志伟,汤国辉,赵强,等. AKT-P27 kip1-cyclin E 在胃癌组织中的表达及意义[J]. 世界华人消化杂志，2011,19(21):2233-2240

[5] 冯晓洁,罗欣,陈洪伟,等. Cyclin D1,Cyclin E,c-Myc在涎腺良恶性多形性腺瘤中的表达研究[J]. 口腔医学研究,2011,27(12):1089-1093

[6] 张桂珍. Cyclin E、P27、P53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性[J]. 病理与临床，2011,49(28):112-113

[7] Jean-Francois V,Francis L,Maryse D,et al. Flow cytometry study of human cyclin B1 and cyclin E expression in leukemic cell lines:cell cycle kinetics and cell localization[J]. Experimental Cell Research,1999,247:208-219

[8] Rakitina TV,Vasilevskaya IA. O’Dwyer PJ. Inhibition of G1/S transition potentiates oxaliplatin-induced cell death in colon cancer cell lines[J]. Biochem pharmacol,2007,73:1715-1726

[9] Sherr CJ,Roberts JM. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression[J]. Genes Dev，1999,13(12):1501-1512

[10] 赵朋,白铁男,韩瑞发,等. 前列腺癌组织中Skp2、P27、PCNA的表达变化及意义[J]. 山东医药，2011,51(42):58-59

[11] 孔郁,朴熙绪,张媛,等. 胃癌及癌前病变中P27和CyclinE蛋白的表达意义[J]. 世界华人消化杂志，2006,14(13):1300-1304