补肾活血法与益气补血法对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠骨髓基质细胞生长及血清IL-6的影响

陈慧彬，王 茜，窦永起

(解放军总医院，北京 100853)

化疗是治疗恶性肿瘤最重要的手段之一，骨髓抑制是其主要毒副作用，中医最常用益气补血中药进行治疗，但疗效并并不令人满意。笔者多年的临床实践体会到补肾活血法亦可以提高其防治效果。实验研究表明，两法均可减轻化疗后骨髓抑制，促进造血功能的恢复，但有一定差异；两法在某些作用途径和环节上既有差异，又有协同[1]。骨髓基质细胞是造血微环境中的重要组成成分，对造血细胞具有黏附滋养作用，通过分泌细胞因子及其他活性物质对造血干、祖细胞的增殖、分化和生长起重要调控作用。血清白介素-6(IL-6)与造血系统疾病相关，骨髓造血障碍会导致患者血清IL-6分泌增多[2]，同时环磷酰胺(CTX)亦可导致骨髓基质细胞分泌IL-6增多[3]。为了进一步了解两种方法作用机制的差异与协同价值，本研究比较了两种方法对血清IL-6及骨髓基质细胞的影响，现报道如下。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级ICR小鼠80只，雌雄各半，6～8周龄，体质量18～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(军)2007-004，设施合格证号：SYXK(军)2007-004。

1.1.2试剂与仪器 IL-6ELISA试剂盒，全自动多功能酶标仪，微量反应板自动洗板机，自动降温/恒温循环仪，低温离心机，光学显微镜数码照相系统，恒温水浴锅，干燥箱，高压灭菌锅，电热恒温培养箱。

1.1.3药物及制备 补肾活血方由熟地黄、枸杞子、川芎、丹参等组成， 益气补血方由黄芪、当归、党参、鸡血藤等组成。以上药物均由解放军总医院中药房提供，经鉴定后，水煎、过滤，60 ℃浓缩，配制成含生药1 g/mL的药液，置4 ℃保存备用。注射用CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。

1.2方法

1.2.1模型的制作 参照文献[4]方法，CTX溶液100 mg/(kg·d)，腹腔注射1次/d,连续3 d。

1.2.2动物分组及给药 动物随机分为5组：对照组、模型组、益气补血组、补肾活血组、补肾活血加益气补血(中药联合)组，每组16只。参照文献[4]，计算小鼠的等效剂量，补肾活血组17.47 g/(kg·d)、益气补血组17.47 g/(kg·d)、中药联合组20.55 g/(kg·d)，连续灌胃给药至实验结束；对照组和模型组分别给予等体积的蒸馏水。给药第8天开始，除对照组外，其余4组小鼠均于给药第8天给予腹腔注射CTX溶液100 mg/(kg·d)，连续3 d。

1.3指标检测

1.3.1血清IL-6含量检测 采用双抗体夹心ELISA法检测。造模后3 d及造模后7 d各选取8只小鼠股骨动脉取血处死,离心,取上清。检测方法参照试剂盒说明书，将标准品的稀释与加样，封板、温育，将浓缩洗涤液稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加洗涤液，静置后弃去，如此重复5次，拍干，每孔加入酶标试剂，空白孔除外，再温育、洗涤，每孔先加入显色剂，震荡混匀，避光显色后每孔加终止液终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。IL-6浓度与OD450值呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-6浓度。

1.3.2骨髓基质细胞培养 分别在开始造模的第3天、第7天24 h后，颈椎脱臼处死各组8只小鼠，用75%乙醇浸泡，无菌超净台条件下取出股骨，用6号针头以DMEM培养基反复多次冲出骨髓细胞，再换4号针头抽打过滤制成单个骨髓细胞悬液，充分混匀同组单细胞悬液，将骨髓抑制小鼠有核细胞1×109L-1接种于含15%胎牛血清的DMEM培养基中，每组重复接种6孔，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养，3 d后半量换液，培养7 d及14 d后，观察骨髓基质细胞生长情况，并用二乙酸荧光素染色后照相。

2 结 果

2.1各组小鼠血清IL-6水平比较 造模后第3天，模型组及中药组小鼠血清中的IL-6水平较对照组均明显升高(P均<0.01)，且3个药物组明显低于模型组，尤以中药联合组明显，补肾活血组次之(P<0.05)。造模后第7天，模型组与各药物组IL-6水平均明显下降(P均<0.01)，其中模型组IL-6水平最高，补肾活血组次之，中药联合组最接近对照组(P>0.05)。见表1。

2.2各组骨髓基质细胞生长比较 开始造模后3 d取骨髓基质细胞培养14 d，模型组贴壁细胞数量减少，梭形成纤维细胞比例降低，大多数细胞胞核不清楚，一些胞体模糊的变性退变细胞光镜下可见，细胞融合差；而各中药组骨髓基质细胞较模型组增殖活性明显，呈平行样或漩涡状生长，且能形成少量集落，荧光染色后示细胞融合性好。造模后第7天取各组骨髓基质细胞经培养14d后贴壁细胞数量及成纤维细胞集落与对照组比较无明显差异。见图1及图2。

表1 对外周血细胞因子IL-6的影响比较

注:①与对照组比较，P<0.01;②与模型组比较，P<0.01；③与造模后3 d组比较，P<0.01；④与对照组比较，P>0.05。

3 讨 论

IL-6是一种具有广泛造血及免疫调节作用的细胞因子，可由骨髓基质细胞中成纤维细胞、成骨细胞等分泌，能促使多能干细胞进入细胞周期，促使骨髓中红系和粒系的增生，增加外周血中性粒细胞、红细胞和血小板数目。IL-6与其他细胞因子一样， 不仅在局部起作用，而且在特定状态下可以大量分泌进入血液循环。有报道放化疗致骨髓抑制小鼠骨髓基质细胞培养上清液中IL-6表达水平显著高于正常组，显示射线及化疗药物会引起骨髓基质细胞IL-6分泌增多[5]。实验中的造模药物CTX属烷化剂[6]，呈非细胞周期特异性的细胞毒性作用，在杀伤迅速增殖的肿瘤细胞同时，也损伤了多数处于增殖周期的定向干细胞，在急性应激期内，造血功能低下，机体会代偿性分泌IL-6以促进骨髓腔内残留的原始干细胞增殖、分化，进而进入外周循环池，以恢复处周血细胞水平。本实验中，造模后小鼠血清造血细胞生长因子IL-6表达水平均高于对照组。

图1 造模后第 3 天各组小鼠骨髓基质细胞(荧光染色，×200)

图2 造模后第 7天各组小鼠骨髓基质细胞(荧光染色，×200)

BMSC来源于骨髓间充质干细胞，是支持造血实质细胞生存的造血微环境中的一部分，其黏附结构调节造血干、祖细胞回髓定位，并通过分泌细胞因子IL-6等调控造血。本实验中模型组造模后基质细胞受到严重损伤，与CTX损伤骨髓基质细胞前体间充质干细胞有关。有文献报道，高水平的IL-6会导致骨髓基质细胞的凋亡[7]。骨髓抑制小鼠造血功能低下，机体代偿性异常分泌IL-6，高表达的IL-6又刺激了肿瘤坏死因子TNF的产生，而TNF量的提升又反过来刺激了IL-6的进一步分泌，从而加强了负向调控造血作用，且高水平表达的IL-6参与了骨髓基质细胞的凋亡。李楠等[8]在观察IL-6对体外培养SD大鼠骨髓基质细胞凋亡的影响时，发现IL-6高表达可使大量细胞停留在G1期，阻滞细胞进入S期，使DNA合成受阻；IL-6高表达还使细胞的Baxm RNA表达、凋亡率和线粒体膜电位改变增高，Bcl-2 mRNA表达呈下降趋势，促进Bax从胞浆中移至线粒体膜上而使Bax在与Bcl-2形成的异二聚体中占据优势来促进线粒体上的PT孔道开放，使内膜离子通道改变，线粒体内膜电位下降或丧失，导致Cystic等蛋白的释放，从而调节细胞凋亡，促进骨髓基质细胞的凋亡。因此，IL-6对造血呈现双向调节的量效作用。

本实验结果表明，经中药治疗后IL-6的表达水平较模型组明显下降，说明补肾活血方和益气补血方对高水平 IL-6 均具有明显的下调作用，益气补血法的调节作用优于补肾活血法，两法联用调节效果更佳，且各中药组骨髓基质细胞较模型组增殖活性明显，说明3个中药组均可以防治化疗导致的骨髓造血功能损伤，促进造血功能的恢复，补肾活血方和益气补血方联合运用可以增强其对造血因子的调控。

化疗药引起骨髓抑制在中医常属“虚劳”、“血虚”范围，治疗以扶正为主，以补气养血为原则，补肾活血，益气健脾生血。传统中医理论认为，肾主骨生髓藏精，精血同源，精血互生；脾为后天之本、气血生化之源。益气补血方为当归补血汤加减化裁，重用黄芪大补脾肺之气，以裕生血之源;更用当归益血和营，以使阳生阴长，气旺血生；党参能补养中气，调和脾胃；白芍养血敛阴，不惟治血虚，大能行气；鸡血藤能去瘀血，生新血，流利经脉。补肾活血方中熟地补血养阴，填精益髓，虚损血衰之人须用之；何首乌能养血益肝，固精益肾；枸杞子味甘多液，为滋补肝肾最良之药；川芎能破结宿血，养新血；丹参祛瘀、活血养血通经。两方合用，能补肾、益气、活血，疗效更佳。

[参考文献]

[1] 王茜,杨旭辉,高月,等. 补肾解毒活血法与益气补血法对骨髓抑制小鼠造血功能影响的比较研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2012,18(1):182-185

[2] 常丽. 补髓生血颗粒治疗慢性再生障碍性贫血的疗效及对患者血清IL-6的影响[D]. 哈尔滨：黑龙江中医药大学,2006

[3] 陈永锋. 维肝力对骨髓抑制小鼠造血调控影响的实验研究[D]. 成都:四川大学,2007

[4] 陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京:人民卫生出版社,2006:1167

[5] 朱波,罗成基,魏永江,等.60Coγ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞IL-6表达的影响及机制研究[J]. 辐射研究与辐射工艺学报,2001,19(3):214-217

[6] 李端. 药理学[M]. 6版. 北京:人民卫生出版社,2007:8

[7] 李如英,钱新宏,郑跃杰,等. 再生障碍性贫血患者造血细胞因子的研究[J]. 第四军医大学学报,2001,22(4)：371-372

[8] 李楠,林旭,王和鸣,等. IL-6影响骨髓基质细胞凋亡机理的初步探讨[J]. 中国骨质疏松杂志，2005,11(1):12-16