化橘红有效成分柚皮苷对高糖诱导CMECs凋亡的抑制作用

游琼 吴铿 黄海丽 闫海 莫海亮 叶少强 李上海

化橘红有效成分柚皮苷对高糖诱导CMECs凋亡的抑制作用

游琼 吴铿 黄海丽 闫海 莫海亮 叶少强 李上海

目的 观察化橘红有效成分柚皮苷（Naringin）对高糖诱导心肌微血管内皮细胞（CMECs）凋亡的影响，探讨Naringin对CMECs损伤的保护作用及可能的机制。方法 CMECs系分为正常糖组、高糖组、高糖+Naringin（50、100、200 μmol/L）处理组。Western印迹法检测CMECs p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）（p38）、凋亡相关蛋白Caspase 9的表达及其活性；荧光探针JC-1观察线粒体膜电位。结果 ①高糖刺激CMECs p38 MAPK信号通路的激活，p38蛋白表达明显上调，正常糖对照组仅有少量p38蛋白表达；高糖+Naringin（50、100、200 μg/ml）组 p38 蛋白表达量较高糖组明显下降（P＜0.05）。②高糖培养诱导 CMECs 48 h后可见Caspase 9的表达及其活性明显增加，与正常糖组比较差异有统计学意义（P＜0.05），相应CMECs线粒体膜电位降低；naringin（50、100、200 μmol/L）预处理 CMECs，明显抑制高糖诱导的 CMECs Caspase 9 表达及其活性，差异均有统计学意义（P＜0.05），抑制率分别是50%、64%、68%和54%、65%、68%；CMECs线粒体膜电位也不同程度降低。结论 化橘红有效成分Naringin（50、100、200 μmol/L）能够减少高糖诱导的CMECs凋亡，可能与其抑制p38 MAPK活化相关，并呈一定浓度依赖性。

心肌微血管内皮细胞； 凋亡； p38丝裂原活化蛋白激酶； 柚皮苷； 高糖

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是糖尿病最常见的并发症之一，是导致慢性充血性心功能衰竭及糖尿病患者致残和死亡的重要原因[1-3]。目前DC的早期防治已引起了各国学者的高度重视，并进行了大量的研究，但DC确切的发病机制至今仍不清楚，临床仍缺乏早期预测指标和有效防治的药物[4-6]。因此，如何防治DC已成为当前医学上的攻关重点。我们的前期动物实验研究发现，柚皮苷主要通过抑制心肌的炎症损伤对DC起着防治作用[7-9]。可以预见，以抑制炎症为切入点，以抑制p38丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-avtivated protein hinase，MAPK）炎症通路对抗心肌微血管内皮 细 胞 （cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）凋亡及线粒体损伤为突破口，探讨中药化橘红有效成分单体naringin如何减轻DC CMECs炎症损伤，提高CMECs对高血糖的耐受性，对控制DC的发生发展具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 心肌微血管内皮细胞系（CMECs）（美国ATCC公司），新生小牛血清和DMEM培养基（美国Gibco公司）；柚皮苷（纯度：HPLC法98%，广东医学院药物开发中心提供，从化橘红中提取纯化）；兔抗人p38抗体（美国Sigma公司）；Caspase 9单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Caspase 9活性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（碧云天生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；FragELTMDNA Fragmentation Detection Kit、BCA蛋白定量试剂盒、HRP结合的二抗、ECL化学发光试剂盒（上海吉泰生物技术有限公司）。TS100倒置显微镜（日本Nikon），Leica荧光显微镜（德国），Beckman高速离心机（美国），Biorad电泳仪、Biorad半干转膜仪、AlphaImager HP荧光/可见光凝胶成像分析系统（美国），TECAN GENios Pro多功能酶标仪（瑞士）。

1.2 方法 CMECs培养及分组：取CMECs系，调整细胞密度至每毫升1×104个，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液200μl，分为正常糖（葡萄糖浓度：11 mmol/L）组，高糖（葡萄糖浓度：33 mmol/L）组及高糖+柚皮苷高、中、低剂量（50、100、200 μg/ml）组，培养48 h后进行以下检测。

1.2.1 线粒体膜电位检测 线粒体膜电位检测使用碧云天生物技术研究所线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）。吸除培养液，根据实验具体情况，如有必要可以用PBS或其他适当溶液洗涤细胞1次，加入1 ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混匀，细胞培养箱中37℃孵育20 mim。在孵育期间，按照1 ml JC-1染色缓冲液（5×）加入4 ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次，加入2 ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。荧光显微镜下观察。

1.2.2 Western blotting 取50 μg蛋白样品与上样缓冲液变性后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，转移后的PVDF膜置于脱脂奶粉的洗涤缓冲液，室温下在摇床轻摇封闭2 h，洗3次后加入一抗（兔抗人p38抗体、Caspase 9单克隆抗体），4℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜置于ECL化学发光反应液中室温孵育3 min，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X线胶片曝光，胶片用AlphaImager HP荧光/可见光凝胶成像分析仪处理，并用分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。

1.2.3 Caspase 9活性检测 使用碧云天生物技术研究所Caspase 9活性检测试剂盒。吸取细胞培养液，备用。胰酶消化细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600 g，4℃离心5 min，收集细胞，PBS洗2次，吸干上清后加入裂解液重悬沉淀。冰上裂解15min，4℃，16 000 g离心15 min，将上清转移到预冷的离心管中，立即进行Caspase 9酶活性检测。在上清中加入预冷的Ac-LEHD-pNA（2 mM）后混匀，37℃孵育2 h，发现颜色变化比较明显时检测A450。根据试剂盒说明书对检测结果进行换算。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计软件分析处理。实验数据用±s表示，用One-way ANOVA检验，组间两两比较方差齐时采用SNK法，方差不齐时采用Dunnett’s T3法，显著性标准为P<0.05。

2 结果

2.1 柚皮苷对高糖诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡的影响 由图1可见，相对于对照组，高糖培养CMECs，可明显诱导CMECs DNA片段化的产生，上调CMECs的Caspase 9表达及其活性，50、100、200 μmol/L柚皮苷预处理CMECs，可明显抑制高糖诱导的CMECs Caspase 9表达及其活性，差异均有统计学意义（P<0.05）。抑制率分别是50%、64%、68%和54%、65%、68%。

图1 柚皮苷对高糖诱导CMECs Caspase 9表达及其活性的影响

2．2 柚皮苷对线粒体膜电位的影响 如图2所示，各组绿色荧光无明显改变，所以只分析与高的线粒体膜电位（△Ψm）相应的红色荧光的变化。正常组心肌细胞△Ψm普遍较低，以绿色荧光（低膜电位）为主。随着高糖诱导CMECs凋亡明显，绿色荧光逐渐减弱，而红色荧光（高膜电位）逐渐加强，说明△Ψm 逐渐增高。加柚皮苷（50、100、200 μmol/L）预处理后，与高糖组△Ψm比较，抑制率分别为48%、55%和72%，说明柚皮苷对高糖诱导线粒体膜电位损伤有保护作用。

2.3 柚皮苷对MAPK/P38信号通路的调控 由图3可见，相对于对照组，高糖培养CMECs，MAPK/P38 的表达明显增加；50、100、200 μmol/L 柚皮苷预处理CMECs，可以抑制高糖诱导MAPK/P38的表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。抑制率分别是40%、56%和62%。

图3 柚皮苷对高糖诱导CMECs MAPK/P38表达的影响

3 讨论

心脏是糖尿病累及的主要器官之一。DC的发病机制涉及微血管病变、心肌纤维化（fibrosis）、间质炎症、氧化应激损伤及钙内稳态异常等各个方面[5,10，11]。随着研究的不断深入，CMECs损伤及其致病机制逐渐被人们所认识，并成为研究热点。CMECs是一类覆盖于心肌微血管腔内表面，具有不同于心脏血管内皮细胞的多种功能特异性细胞，在炎症反应中扮演重要角色，是DC的首发部位，也是DC发生发展的始动环节，故CMECs成为防治炎症损伤的靶点[3]。

目前认为，MAPK家族中的重要成员之一，p38MAPK在DC的发生中被激活[12,13]。在哺乳类的多种实验模型，p38MAPK通路能被环境应激及炎症细胞因子所激活，并参与细胞死亡[14-19]。有报道指出，p38MAPK通路是糖尿病血管病变的共同炎症通路[20]。在STZ诱导的DCM模型，磷酸化（代表被激活）p38 MAPK表达明显增多[12,13]。具有抗炎及抗氧化作用的大麻二酚（Cannabidiol）在抑制p38 MAPK通路的同时，也能明显抑制炎症因子（如TNF-α、iNOS、NFκ-β） 及细胞凋亡[13]，提示 p38 MAPK通路与DC炎症及细胞凋亡密切相关，通过p38 MAPK通路引起的炎症可能在DC的发生发展中起着重要的作用[21]。本实验中我们检测到高糖刺激CMECs p38 MAPK信号通路的激活，p38蛋白表达明显上调，正常糖对照组仅有少量p38活化；同时我们检测证实，高糖培养诱导CMECs细胞Caspase 9表达及其活性明显增加，相应的CMECs线粒体膜电位降低。

提及化橘红，人们首先想到的是“南方人参”和“一片值千金”之称谓。清《本草纲目拾遗》载：“橘红果皮辛、苦，性温，理气燥湿、温肺化痰、治肺寒咳多痰、胸膈胀闷、呕吐嗳气等症。”随着科学技术的进步，学者们本着“古为今用”、“承前启后”的宗旨，应用现代生物技术和方法对化橘红的有效成分单体柚皮苷（Naringin）进行了提取及分子结构分析。Naringin又称柚甙、柑橘甙、异橙皮甙，是一种双氢黄酮类化合物。除了化橘红外，Naringin也是中药骨碎补、枳实、枳壳的主要有效成分。近年，在离体细胞模型和在体实验均证实，柚皮苷具有多种生物学活性及药理作用，特别是具有明显的糖脂代谢作用，能有效地防治心血管疾病[7-9,22]。我们的研究结果表明，在高糖环境下，48 h可见明显细胞凋亡，Naringin（50、100、200 μmol/L）干预后，可以明显减轻高糖诱导的CMECs凋亡，明显下调MAPK/P38的表达，并呈一定的浓度依赖性。

综上所述，本研究证实化橘红的有效成分单体Naringin可通过部分抑制p38 MAPK活化，减少高糖诱导的CMECs凋亡，起到保护心脏作用。这为揭示DC的发病机制提供新的研究方向，为其防治拓展新的思路，为应用Naringin治疗DC提供新的实验依据，并奠定理论基础。

图2 柚皮苷对高糖诱导CMECs线粒体膜电位的影响

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Inhibition of Pummelo Peel active ingredient Naringin on high glucose-induced CMECs apoptosis

YOU Qiong，WU Keng，HUANG Hai-li，et al.Division of Cardiology，Department of Internal Medicine，Clinical Scientific Research Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

WU Keng，E-mail：zjwukeng@hotmail.com

Objective To explore the therapeutic effects of Pummelo Peel active ingredient Naringin on high glucose-induced cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） injury and understand its mechanism．Methods The CMECs system were divided into normal glucose group（NG），high glucose group（HG）and HG with Naringin at high，medium and low dose（50，100，200 μmol/L） group.The expression of p38MAPK and the expression and activity of Caspase 9 were determined by Western blot mitochondrial membrane potential was detected by Fluorescence probe JC-1.Results ⑴CMECs with high glucose could activate the p38 MAPK signaling pathway.The expression of p38MAPK was significantly elevated．Little expression of p38MAPK was observed in NG．As compared to HG，the expression of p38MAPK was significantly lowered in Naringin groups．⑵The expression and activity of Caspase 9 increased in HG with upregulated mitochondrial membrane potential after 48 h．It was significantly higher than those in NG.Naringin（50，100，200 μmol/L）could reduce the CMECs Caspase 9 in－duced by high glucose 50%，64%，68%and 54%，65%，68%respectively，and downregulated mitochondrial membrane potential．Conclusion Naringin can inhibit high glucose-induced CMECs apoptosis．And this effect may be involved in its inhibition of activation of p38MAPk，and a certain concentration dependence.

Cardiac microvascular endothelial cells； Apoptosis； p38 mitogen-activated protein kinase； Naringin； High glucose

广东省重大科技专项（项目编号：2012A080202020）；

广东省中医药局资助项目（项目编号：20121112）；

524001 湛江市，广东医学院附属医院心血管内科，广东医学院附属医院临床科研中心

吴铿，E-mail:zjwukeng@hotmail.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．07．015

R542.2+2

A

1672-5301（2014）07-0629－04

2014-03-06）

湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目（项目编号：湛科［2011］79号）；

广东医学院科研基金（项目编号：M2011031）