AKT/PI3K信号通路介导的干细胞动员在抗心梗后心律失常中的作用

苏枫 王加红 陈楠楠 姚建华 唐静辉 龚群林 张少衡

基础研究

AKT/PI3K信号通路介导的干细胞动员在抗心梗后心律失常中的作用

苏枫 王加红 陈楠楠 姚建华 唐静辉 龚群林 张少衡

作者单位：200090 上海市，同济大学附属杨浦医院心内科

目的 探讨心肌梗死（MI）后丝氨酸/苏氨酸/磷脂酰肌醇-3激酶（AKT/PI3K）信号通路介导的心脏干细胞（CSCs）动员对抗心梗后心律失常的影响。方法 将大鼠随机分为5组，每组20只：对照组（CON组）、结扎组（LI组）、结扎+注射组（LI+LY 组）、缺血预处理+结扎组（IP+LI组）、缺血预处理+结扎+注射组（IP+LI+LY组）。采用结扎LAD的方法建立心梗模型，采用流式细胞分析、ELISA法等检测各组AKT/PI3K信号通路相关指标的表达情况及心律失常的发生情况。结果 LI+LY组炎症反应显著高于其他各组，IP+LI组显著低于 IP+LI+LY 组、LI+LY 组、LI组（P＜0.05）；IP+LI组比 LI组 CD34+、Oct4+细胞的数量多（P＜0.05）；与CON组相比，IP+LI组SDF-1表达显著增加，LI+LY组及LI组表达明显减少（P＜0.05）；与LI组比较，IP+LI组心律失常的发生率明显降低，QTc间期也明显缩短（P＜0.05）。结论 通过激活内源性Akt/PI3K信号通路，可有效促进内源性心脏干细胞动员及归巢，使心肌细胞再生，从而改善心脏功能，降低心肌缺血后室性心律失常的发生。

信号通路； 心肌梗死； 心律失常； 干细胞动员； 丝氨酸苏氨酸激酶； 1-磷脂酰肌醇-3激酶

急性心肌梗死（AMI）是引起心血管疾病死亡的主要原因之一，超过50%的幸存者死于室性心律失常[1]。早期预防和治疗AMI后室性心律失常已成为降低AMI患者死亡率的重要措施。AMI后梗死心肌自身存在的心脏干细胞（CSC/CPCs）可通过自我更新、克隆增殖实现干细胞修复[2]。但CSCs数量极为有限，其再生能力无法满足受损的心肌细胞与心脏功能，故研究通过动员CSCs使其最大限度地促进AMI后心脏修复已成为研究的焦点问题。研究发现，丝氨酸苏氨酸激酶/1-磷脂酰肌醇-3激酶（AKT/PI3K）信号通路与梗死心肌中CSCs的动员、迁移密切相关[3,4]。本研究利用结扎大鼠左冠状动脉前降支（LAD）制备动物模型，观察AKT/PI3K信号通路相关分子的表达情况，分析其与动物心脏心律失常发生的内在联系，以期阐明AKT/PI3K信号通路介导的干细胞动员对抗心梗后室性心律失常的作用。

1 资料与方法

1.1 主要材料 健康SD大鼠（100只）购自中国科学院动物所，体质量 250～300（278.1±12.3）g。

1.2 实验分组 将大鼠随机分为5组，每组20只。①对照组（CON组）：开胸，在LAD下穿线但不结扎；②结扎组（LI组）：开胸，在LAD下穿线结扎；③结扎+注射组（LI+LY组）：结扎LAD即刻在坏死心肌部位注射LY294002 0.3 mg/kg；④缺血预处理+结扎组（IP+LI组）：结扎LAD 5 min松开再灌注5 min，重复3次后再结扎30 min再灌注120 min，再行结扎处理；⑤缺血预处理+结扎+注射组（IP+LI+LY组）：先行缺血预处理，结扎LAD即刻在坏死心肌部位注射LY294002 0.3 mg/kg，操作方法同上。

1.3 动物模型制备 采用氯胺酮（50 mg/kg）麻醉大鼠后行气管插管，呼吸机辅助通气。于左胸第4肋间开胸，切开心包，在左心耳下缘与肺动脉圆锥之间结扎LAD，由心电图和心脏颜色变化证实心肌梗死模型制备成功。实验动物操作过程遵照上海市杨浦区中心医院动物伦理委员会规程进行。

1.4 检测指标

1.4.1 炎症及坏死指标测定 取梗死区心肌组织制成5%的匀浆液，采用比色法测定髓过氧化物酶（MPO）、活性氧（ROS）的含量，采用荧光定量PCR检测hs-CRP浓度，操作步骤按说明书进行。

1.4.2 流式细胞分析 取外周血50 μl，再分别加入直接荧光标记抗体 FITC-Lin、PE-CD45、Alexa Fluor 647-CXCR4及同型对照抗体，染色30 min，加入溶血素2 ml裂解红细胞10～15 min，离心后弃上清液，PBS洗涤细胞2次，标本置于流式细胞仪检测外周血中CD34+、Oct4+、VSEL细胞数量。

1.4.3 ELISA检测 取心肌缺血组织的匀浆液，采用ELISA法测定Akt、基质细胞衍生因子1（SDF-1）水平，操作步骤按说明书进行。

1.4.4 心律失常 麻醉大鼠，四肢皮下插入针电极接监护仪行心电监护0.5 h，描记心电图，观察QTc间期、室性心律失常发生情况。

1.5 统计学方法 运用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组炎症及坏死指标比较 H&E染色显示，与CON组比较，心肌梗死显著引起的炎症，包括中性粒细胞浸润，心肌细胞丢失和出血方面，没有预适应的结扎鼠比带预适应结扎鼠的局部缺血反应更严重。LI+LY组炎症指标包括hs-CRP、MPO和ROS的定量指标显著高于CON组及其他各组，IP+LI组各炎症指标显著低于IP+LI+LY组、LI+LY组和LI组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组炎症及坏死指标比较（±s）

表1 各组炎症及坏死指标比较（±s）

注：与 CON 组比较，aP＜0.05；与 LI+LY 组比较，bP＜0.05；与 IP+LI组比较，cP＜0.05

组别 例数 hs-CRP（ng/ml）MPO（nmol/L）CON 组 20 508.70±13.30 14.71±4.63 2.41±1.17 IP+LI+LY 组 20 573.50±21.70abc20.40±9.30abc3.39±1.44abcLI+LY 组 20 871.10±51.70a28.13±5.24a5.17±1.76aIP+LI组 20 519.50±71.60ab15.51±4.32ab2.59±1.42bLI组 20 576.30±41.74abc22.14±4.18abc3.73±1.74abcROS（nmol/L）

2.2 血循环CD34+、Oct4+、VSEL在各群体中的比较 流式细胞仪显示，CON组、IP+LI+LY组、LI+LY组无差异。然而，同样没有注射LY294002，IP+LI组比LI组CD34+、Oct4+细胞数量多。见表2。

2.3 心肌缺血中的Akt和SDF-1表达 与CON组相比，IP+LI组SDF-1表达显著增加，LI+LY组及LI组表达明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。LI+LY组及LI组SDF-1表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组Akt的表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.4 各组室性心律失常的发生 与LI组比较，IP+LI组心律失常的发生率明显降低，QTc间期也明显缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表2 血循环CD34+、Oct4+、VSEL在各群体中的比较（±s）

表2 血循环CD34+、Oct4+、VSEL在各群体中的比较（±s）

注：与 LI组比较，aP＜0.05

组别 例数 CD34+（105/L） Oct4+（105/L） VSEL（105/L）CON 组 20 48.7±7.3 12.74±3.36 42.4±10.7 IP+LI+LY 组 20 51.5±9.7 19.40±5.32 43.9±9.4 LI+LY 组 20 51.9±10.1 26.14±5.38 44.1±9.6 IP+LI组 20 53.3±11.6a14.93±4.28a42.5±11.2 LI组 20 48.1±9.4 22.08±5.63 43.7±8.7

表3 各组心肌缺血中的Akt和SDF-1表达（±s）

表3 各组心肌缺血中的Akt和SDF-1表达（±s）

注：与 IP+LI组比较，aP＜0.05；与 CON 组比较，bP＜0.05

组别 例数 Akt SDF-1（pg/mg）CON 组 20 0.075±0.013 7.62±1.27 IP+LI+LY 组 20 0.084±0.023 7.95±1.35aLI+LY 组 20 0.068±0.014 5.11±1.64abIP+LI组 20 0.082±0.012 13.72±4.73bLI组 20 0.079±0.023 5.02±1.04ab

表4 各组室性心律失常发生情况［±s，例数及百分率（%）］

表4 各组室性心律失常发生情况［±s，例数及百分率（%）］

注：与 CON 组比较，aP＜0.05；与 LI组比较，bP＜0.05

组别 例数 QTc间期（ms） 心律失常的发生率CON 组 20 412.075±51.13 3（15.0）IP+LI+LY 组 20 441.784±49.05a15（75.0）aLI+LY 组 20 439.568±45.03a13（65.0）aIP+LI组 20 430.12±41.02b18（90.0）abLI组 20 458.81±52.73a12（60.0）a

3 讨论

研究表明心肌梗死后梗死心肌自身存在C-Kit、MDR、Sca-1、Isl-1、MDR 等多种 CSCs，具有自我更新、克隆增殖的功能，可在心脏组织内分化为心脏的多种细胞成分，在梗死心肌形成一个天然的干细胞修复过程，并对存活心肌的电和机械功能产生重要影响[5,6]。但AMI后心脏自体存在的CSCs数量非常有限，且慢性缺血心肌这种分化进一步减少，故其再生能力远不足以弥补损伤的心肌细胞数量和心脏功能。目前研究认为，AKT/PI3K信号通路与梗死心肌中CSCs的动员、迁移密切相关，可调控循环血干细胞归巢、梗死心肌局部干细胞生存和血管新生，促进梗死心肌功能修复并降低死亡率[7,8]。但其对心梗后室性心律失常的影响尚不明确。

缺血预处理（IPC）是一种内源性心肌保护方法，可减少心肌缺血再灌注过程中的氧自由基，抑制去甲肾上腺素的过度分泌等，发挥心肌保护作用[9]。H&E染色显示，未预适应的结扎鼠较预适应结扎鼠的中性粒细胞浸润、心肌细胞丢失及局部缺血反应更严重，且LI+LY组炎症反应显著高于CON组及其他各组，IP+LI组显著低于IP+LI+LY组、LI+LY 组、LI组（P＜0.05），进一步说明 IPC 能改善缺血再灌注心肌的功能，减轻心肌损伤，具有明显的心肌保护效应。此外，IP+LI组SDF-1表达明显增加，而Akt抑制剂能明显减弱SDF-1的表达，但无法改变Akt的表达水平，其原因是Akt抑制剂只能降低Akt的磷酸化水平，提示在心脏性猝死动物心肌梗死模型中，IPC对Akt/PI3K介导的信号途径调节干细胞归巢可产生有利影响[10]。有研究发现，SDF-1和内皮祖细胞（EPCs）表面的CXCR4介导了EPCs的迁移，但这种迁移可被Akt抑制剂所阻断[11]。梗死区的SDF-1/CXCR4轴在介导干细胞归巢的同时，还可激活PI3K/Akt/eNOS等下游路径，通过Akt介导的信号通路动员干细胞归巢至梗死心肌，从而对心肌细胞提供营养保护支持，维护心电稳定，发挥抗心肌梗死后室性心律失常的作用[12,13]。

流式细胞仪显示，CON组、IP+LI+LY组、LI+LY组CD34+、Oct4+细胞的数量无差异，但同样没有注射 LY294002，IP+LI组比 LI组 CD34+、Oct4+细胞的数量多，表明CD34+、Oct4+对维持心肌细胞及CSCs的存活具有重要作用，其作用可能与PI3K/Akt信号通路有关。有学者发现，QTc间期延长是慢性心力衰竭心源性猝死的独立预测指标，可能与神经内分泌系统过度激活有关[14]。与LI组比较，IP+LI组心律失常的发生率明显降低，QTc间期也明显缩短（P＜0.05），说明IPC可显著改善血流动力学，减少心肌梗死后心律失常的发生。

综上所述，在心肌梗死早期，通过激活内源性Akt/PI3K信号通路，可有效促进内源性心脏干细胞动员及归巢，使心肌细胞再生，从而改善心脏功能，降低心肌缺血后室性心律失常的发生，同时也为干细胞再生心肌减少室性心律失常研究提供新的理论依据。

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Study on the role of stem cell mobilization mediated by AKT/PI3K signaling pathway in the cardiac arrhythmia after myocardial infarction

SU Feng，WANG Jia-hong，CHEN Nan-nan，et al.Department of Cardiology，Yangpu Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200090，China

Objective To explore the influence of CSCs stem cell mobilization mediated by AKT/PI3K signaling pathway on the cardiac arrhythmia after myocardial infarction.Methods 100 Male rats were divided randomly into five groups（n=20）including control group（CON），ligation group（LI），ligation+LY294002 group（LI+LY），ischemic preconditioning+ligation（IP+LI），ischemic preconditioning+ligation+LY294002（IP+LI+LY）.MI model was induced by left anterior descending artery ligatior（LAD），flow cytometry and ELISA were used to detect the expression of AKT/PI3K related indicators，and the incidence of cardiac arrhythmia was recorded.Results LI+LY group had a significantly higher inflammatory reaction than CON group and other groups，and IP+LI group was significantly lower than IP+LI+LY，LI+LY，LI group（P＜0.05）.The number of CD34+，Oct4+in IP+LI group were significantly more than LI group（P＜0.05）.Compared with CON group，the expression of SDF-1 in IP+LI group were significantly increased，but they were decreased significantly in LI+LY group and LI group（P＜0.05）.Compared with LI group，the incidence of arrhythmia in IP+LI group was obviously lower，QTc interphase also significantly reduced（P＜0.05）.Conclusion By activating endogenous PI3K/Akt signaling pathway,which can effectively promote endogenous cardiac stem cells mobilization and homing，enhancement of myocardial cell regeneration，and improve heart function，reduce the occurrence of arrhythmia after MI.

Signaling pathway； Myocardial infarction； Arrhythmia； Stem cell mobilization； AKT；PI3K

上海市卫生局课题面上项目（项目编号：21034334）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.017

Q95-33；R541.7

A

1672-5301（2014）08-0732－04

2014-05-20）