天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

李亚兰 张全伟 王雪莹 马友记 张勇 赵兴绪

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors，IGFs）是生长激素（Growth hormone，GH）发挥作用的介质，主要在肝脏中合成，具有促进有丝分裂、诱导细胞分化、调节生长等作用。IGFs包括IGF-1和IGF-2两种同源多肽，两个单链多态分子在氨基酸组成上同源性为62％，与胰岛素原（Proinsulin）同源性为 50％［1，2］。1976年，Rinderknecht和 Humbel通过将NSILA测序，发现了不同的生长因子，由于它们在结构上与胰岛素非常相似，功能上也有部分相同，所以被正式命名为胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2（Insulin like growth factor，IGF-2）［3］。其中，IGF-2也被称为生长调节素 A（Somatomedin A），刚转录出来的原始IGF-2是由156个氨基酸残基组成的多肽链，经过后续的剪切加工形成成熟的IGF-2，是由67 个氨基酸残基组成的小分子弱酸性多肽。IGF2分子中包括了胰岛素分子内所有的半胱氨酸、赖氨酸及大多数非极性氨基酸，证明它们是由同一个祖蛋白进化而来的［4］。IGF-2能促进细胞的有丝分裂和分化，参与基因组重建，与X染色体的失活有重要关系［5］。此外，IGF2与个体脂肪沉淀、生长速度等生产性能关系密切［6，7］，因此可作为影响牦牛肉质性状的候选基因。已有研究表明IGF-2基因有不依赖牦牛骨骼增长而增加体重的作用［8］。目前，国内外关于IGF-2基因及其编码的蛋白在人及一些动物中已得到深入研究，但迄今尚未有牦牛IGF-2基因cDNA全序列的相关报道。

天祝白牦牛是分布于天祝县境内海拔3 000 m以上的优势牛种，也是高寒牧区人民的乳、肉等主要食品及皮毛、骨、角等生活用品的原料，在该地区具有不可替代的生态、社会和经济地位。本研究以天祝白牦牛为研究对象，应用RT-PCR技术获得cDNA片段，利用cDNA末端快速扩增（RACE）对IGF-2基因进行克隆和分析，旨在为进一步研究IGF-2基因的结构和功能提供分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

组织样本选自甘肃省天祝县成年健康雄性牦牛，屠宰后马上取其肝脏等脏器组织后放入液氮罐中带回实验室，于-80℃超低温冰箱中保存，备用。

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2×Power Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL500、胶回收试剂盒、pMD-19T载体、菌株E.coliDH5α均购自百泰克生物公司（Bio-Take），3'RACE Kit2nd Generation、5'RACE Kit2nd Generation试剂盒购自于宝生物公司（TaKaRa）。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank已发表的黄 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）IGF-2基 因mRNA序列，利用Oligo 7设计天祝白牦牛IGF-2基因CDS区PCR引物。 根据RT-PCR获得的CDS序列，分别设计5' RACE 和3' RACE的特异引物。引物的相关信息见表1。

表1 RT-PCR引物序列及参数

1.2.2 IGF-2基因CDS区扩增及产物的克隆与测序 根据RNA提取试剂盒操作说明，提取天祝白牦牛肝脏的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，-80℃保存。

取2μg总RNA根据反转录试剂盒说明合成cDNA，反应条件为 48℃，60min；70℃，10min。再以cDNA为模板进行PCR反应，反应总体系为20μL ：cDNA 模板 1μL，上下游引物各 1μL（10μmol/μL），2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，ddH2O补足20μL。反应条件为：95℃预变性4min；94℃45s，59℃ 45s，72℃ 1min，30 个循环 ；72℃延伸10min，4℃保存。制作0.8％琼脂糖检测PCR产物，对PCR产物进行切胶回收，回收产物与pMD19-T载体连接，之后转化到感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，菌落PCR检测的阳性菌送上海生物工程有限公司测序。

1.2.3 IGF-2基因5'和3'端的序列扩增 以总RNA为模板，按TaKaRa 5'-Full RACE Kit以及3'-FullRACE Kit说明书步骤，扩增天祝白牦牛IGF-2基因5'和3'端的序列，将PCR产物连接载体克隆，菌落PCR检测的阳性菌送上海生物工程有限公司测序。

1.2.4 IGF-2基因生物学分析 测序结果经过人工校正后，用DNAMAN软件进行序列拼接。利用MegAlign（DNASTAR）将天祝白牦牛IGF-2基 因 与 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）、 猪（HQ450757.1）、马（ECILGF22）、人（XM005252900.1）、小鼠（NM_010514.3）、大鼠（NM_031511.2）等物种IGF-2 基因氨基酸序列分别进行比对分析，用MAFFT在线软件构建系统进化树［9］。

2 结果

2.1 总RNA的提取

总RNA经紫外分光光度计检测，其紫外吸收值OD260/OD280为1.92；经琼脂糖凝胶电泳后可见28S和18S rRNA各一条带，亮度比接近2∶1，表明本试验所提取的天祝白牦牛总RNA的纯度和完整性较好，可以用于下一步RT-PCR。

2.2 天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA扩增及克隆测序

以天祝白牦牛肝脏组织为cDNA模板，将PTPCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增得到了长度为500bp左右的片段，经测序确定为544bp。5'RACE 和3'RACE分别获得510bp和66bp的特异性条带（图1），经测序对得到的序列拼接，除去冗余序列，得到天祝白牦牛IGF-2 cDNA序列长为1060bp。

图1 3'RACE（A）和5'RACE（B）扩增产物电泳图

2.3 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列分析

获得的天祝白牦牛IGF-2基因长1060bp，包括111bp的5'UTR，409bp的3'UTR，540bp的开放阅读框（ORF），起始密码子ATG位于112 nt，终止密码子TGA位于649 nt（图2），该基因已提交至GenBank，获得登录号为：KF682139。

2.4 天祝白牦牛IGF-2基因蛋白序列分析

根据获得的天祝白牦牛IGF-2基因编码区核苷酸序列，推导出编码179个氨基酸残基组成的蛋白，该蛋白氨基酸中含量最多的为Ala，占氨基酸总数的11.2％。经ProtParam程序分析天祝白牦牛IGF-2蛋白的分子量为19.7kD，理论等电点（pI）为9.11，不稳定系数为59.56，为不稳定蛋白。SMART分析（图2）表明，该蛋白第1-24位氨基酸为信号肽；第25-91位氨基酸为成熟肽，分为B、C、A、D四个区域；第112-166位氨基酸为结构域。

2.5 天祝白牦牛IGF-2基因同源性比较

用DNAMAN软件将天祝白牦牛翻译后的氨基酸序列分别与GenBank中所报道的羊、黄牛、人、大鼠、小鼠和猪的氨基酸序列进行比对，结果（图3）表明，天祝白牦牛IGF-2氨基酸序列与黄牛的同源性最高为94.4％；其次与羊的同源性为91.8％，与猪、人、大鼠和小鼠的同源性分别为85.9％、85.9％、82.3％、80.7％。进化树（图4）分析表明，天祝白牦牛IGF-2 基因座位与黄牛和羊的亲缘关系最近。

图2 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列及推导的氨基酸序列

图3 天祝白牦牛与其他物种IGF-2氨基酸序列间多序列对位排列

图4 IGF-2基因与其他物种系统进化树

3 讨论

本研究采用RACE技术首次成功地克隆得到了天祝白牦牛IGF-2基因编码区的全长cDNA，从该基因的核酸序列推断出IGF-2蛋白质的一级结构。试验得到的天祝白牦牛IGF-2基因 cDNA核苷酸序列和推导的氨基酸序列经NCBI Blast 序列比对，与已报道的牛、马、人及小鼠等物种的 IGF-2 基因具有高度的同源性，说明IGF- 2 基因具有高度的保守性。参照人和其他哺乳动物的IGF-2结构，推测所克隆得到的天祝白牦牛IGF-2的氨基酸序列分为信号肽、B、C、A、D和结构域 6个区域，A 和B 结构域与胰岛素原具有极高的同源性，这些结构域的结构对于受体和结合蛋白识别IGF-2很重要［10］。成熟肽B、C、A、D 4个区域，共有6个半胱氨酸残基，可形成3对二硫键（33-71，45-84，70-75），对维持IGF-2的空间结构起重要作用。从这些结果可以看出IGF-2基因在进化上的保守性。IGF-2是目前研究 较多的印迹基因之一，目前，IGF-2已在人、鼠、羊、猪和牛等物种被确定为印记基因，且正常情况下大多数组织均为母源印记［11，12］，即父源等位基因表达。IGF-2基因在其他哺乳动物中是否存在基因印迹现象，是否也是父源等位基因基因，都有待于进一步的研究。

近年来，家畜经济价值的研究受到广泛关注，牦牛作为一种重要的经济物种，其肉、毛 奶等具有较高的经济价值［13］。由于牦牛生存环境受到多种因素（低氧、寒冷、放牧周期短等）的影响［14-16］，其生长可能被抑制。IGF-2作为牦牛肉质研究的候选基因，其结构和功能的研究具有重要的意义。IGF-2是一种多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化，增殖、胚胎的生长发育以及肿瘤细胞增殖中具有重要的促进作用［17］，通过促进牦牛骨骼发育和肌肉增长，从而增加其产肉量，达到提高其经济价值的效果［14］。本研究对IGF-2结构研究及其功能的预测，为进一步对IGF-2功能研究奠定基础，为牦牛经济价值开发提供参考和理论依据。

4 结论

本研究运用同源序列克隆技术结合RACE技术，获得全长1060bp天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA，并对其氨基酸与编码氨基酸序列特性进行了研究。该基因的成功克隆为进一步研究牦牛IGF-2基因的功能奠定了基础。

［1］Le Roith D. The insulin -like growth factor system［J］. Exp Diabesity Res, 2003, 4：205-212.

［2］Werner H, Adamo M, Robert CT, et al. Molecular and cellular aspects of insulin-like growth factor action［J］.Vitamins and Hormones, 1994, 48：1-58.

［3］Rinderknecht E, Humbel RE. Amino-terminal sequences of two polypeptides from human serum with nonsuppressible insulinlike and cell-growth-promoting activities：evidence for structural homology with insulin B chain［J］. Proc Natl Acad SciUSA, 1976,73（12）：4379-4381.

［4］蒋思文, 彭健, 熊远著.胰岛素样生长因子2 研究进展［J］.遗传,2004, 26（2）：271-273.

［5］Lee MH, Jeon YJ, Lee SM, et al. Placental gene expression is related to glucose metabolism and fetal cord blood levels of insulin and insulin-like growth factors in intrauterine growth restriction［J］.Early Hum Dev, 2010, 86（1）：45-50.

［6］Aslan O, Hamill RM, Davey G, et al. Variation in the IGF2 gene promoter region is associated with intramuscular fatcontentin porcine skeletal muscle［J］. Mol Biol Rep, 2012, 39（4）：4101-4110.

［7］Geisert RD, Chamberlain CS, Vonnahme KA, et al. Possible role of kallikrein in proteolysis ofinsulin-like growth factor binding proteins during the oestrous cycle and early pregnancy in pigs［J］.Reproduction, 2001, 121：719-728.

［8］王丁科, 阎萍, 梁春年, 等. 牦牛IGF2内含子的遗传多态性及其遗传效应分析［J］.华北农学报, 2009, 24（2）：107-111.

［9］MAFFT, version 7.113, Computational Biology Research Center（CBRC）：Tokyo, Japan, 2013.

［10］王丁科, 阎萍, 梁春年, 等. 胰岛素样生长因子2研究进展［J］.动物医学进展, 2008, 29（7）：67-70.

［11］Surani MA. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance［J］.Nature, 2001, 414：122-128.

［12］Dindot SV, Kent KC, Evers B, et al. Conservation of genomic imprinting at the XIST, IGF2 and GTL2 loci in the bovine［J］.Incorporating Mouse Genome Mammalian Genome Genes and Phenotypes, 2004, 15（12）：966-974.

［13］Hu Q, Ma T, Wang K, et al. The Yak genome database：an integrative database for studying yak biology and high-altitude adaption［J］. BMC Genomics, 2012, 13：600.

［14］Jones JI, Clemmons DR. Insulin-like growth factors and their binding proteins：biological actions［J］. Endocrine Reviews ,1995, 16：3-34.

［15］Sandra D, O'Dell, Ian NM Day. Molecules in focus Insulin-like growth factor II（IGF-II）［J］.The International Journal of Biochemistry ＆Cell Biology, 1998, 30：767-771.

［16］Long RJ, Apori SO, Castro FB, Ørskov ER, et al. Feed value of native forages of the Tibetan Plateau of China［J］.Animal Feed Science and Technology, 1999, 80（2）：101-113.

［17］Fazio S, Palmieri EA, Biondi B, et al. The role of the GH-IGF-I axis in the regulation of myocardial growth：from experimental models to human evidence［J］. European Journal of Endocrinology,2000, 142：211-216.