槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞HSP27 m RNA表达和凋亡的影响

于峰，邸彦橙，姜丽丽

（牡丹江医学院红旗医院泌尿外科，黑龙江牡丹江157011）

槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞HSP27 m RNA表达和凋亡的影响

于峰，邸彦橙，姜丽丽

（牡丹江医学院红旗医院泌尿外科，黑龙江牡丹江157011）

目的评价槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞热休克蛋白27（HSP27）mRNA表达和凋亡的影响，初步探讨槲皮素抗前列腺癌的可能作用机制。方法体外培养人前列腺癌PC-3细胞株，随机分为4组：空白对照组；阴性对照组：给予二甲亚砜（DMSO）；高剂量组：给予0.6mg／mL槲皮素150μL；低剂量组：给予0.3mg／mL槲皮素150μL。采用RT-PCR和免疫荧光染色检测PC-3细胞HSP27 mRNA的表达情况；采用TUNEL检测给予槲皮素后PC-3细胞凋亡情况。结果RT-PCR检测各实验组PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平分别为128%、110%、50%和60%，2给药组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。免疫荧光染色结果显示，槲皮素可明显降低HSP27阳性细胞染色强度；TUNEL结果显示，给药组可见大量PC-3细胞凋亡，且呈剂量依赖性，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论槲皮素可抑制HSP27 mRNA的表达和诱导PC-3细胞凋亡，这可能是其抗前列腺癌的机制之一。

槲皮素；前列腺癌；热休克蛋白27；细胞凋亡

热休克蛋白（HSP）作为分子伴侣广泛存在于原核与真核细胞内，参与细胞凋亡、细胞周期的调控以及细胞信号传导等重要的生物学过程，是生物体内具有广泛和重要生物学功能的蛋白质［1］。Fuller等［2］研究发现，HSP和肿瘤的发生发展、转移、肿瘤免疫，抗肿瘤治疗以及肿瘤的预后等关系密切。HSP27是HSP亚家族成员之一，在多种肿瘤细胞中均有过表达，其主要的生物学功能是防止各种应激因素对细胞的损伤。另外，HSP27还与调节细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导等有关［3］。目前HSP27与肿瘤的关系日益受到重视，但是有关HSP27在前列腺癌发生发展及预后中所起的作用仍存在争议。前列腺癌（prostatic cancer）是欧美地区男性最常见的恶性肿瘤，近年来在我国的发病率有逐渐增高趋势［4］。美国前列腺癌发病率占男性肿瘤发病率的第二位，仅次于肺癌［5］。中国前列腺癌发病率虽然低于欧美国家，但是近年来呈快速增长趋势。有研究证实，黄酮、多酚类化合物被认为是预防治疗前列腺癌很有潜力的药物。槲皮素（quereetin）是一种黄酮类化合物，在自然界中广泛存在，除具有多种生物学活性，大量体内外研究证实，槲皮素具有抗感染、抗氧化、清除氧自由基和抗肿瘤等多种作用外［6］，还可通过多种机制抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡等，发挥抗肿瘤活性［7］，在临床上是非常有应用价值和前景的抗肿瘤药物。本研究旨在评价槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞HSP27mRNA表达和凋亡的影响，初步探讨槲皮素抗前列腺癌的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物 槲皮素购自Sigma公司，纯度98%。使用二甲亚砜（DMSO）分别配制成0.3mg／mL（半数有效量［8］）和0.6mg／mL溶液，－20℃冰箱保存，备用。

1.2 细胞株 人前列腺癌PC-3细胞株购自上海艾研生物科技有限公司，分为4组：空白对照组；阴性对照组：DMSO；槲皮素高剂量组：给予0.6mg／mL槲皮素150μL；槲皮素低剂量组：给予0.3mg／mL槲皮素150μL。

1.3 细胞培养与给药 PC-3细胞株保存在含有10%胎牛血清的F12营养培养基（含青霉素100 U／mL和链霉素100μg／mL）。按照细胞密度1×106个／孔接种于6孔板中，37℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后分为4组：空白对照组，阴性对照组，槲皮素高剂量组，槲皮素低剂量组。待80%细胞融合后，更换新鲜培养液，分别加入0.6、0.3mg／mL槲皮素150μL，空白对照组不给药，阴性对照组给予等体积DMSO。收集培养液用于后续分析。

1.4 RT-PCR检测PC-3细胞HSP27mRNA的表达 按照说明书，TRIzol试剂盒抽提总RNA，溶于20μL DEPC-H2O，依次加入2.5μL DNA酶，2.5μL 10×buffer，37℃水浴30min后，65℃水浴10min，分光光度法检测RNA浓度。HSP27 PCR引物是：5′-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3′（正向）和5′-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3′（反向），GAPDH扩增产物：5′-GGTCAACGGGTAGGTGTTTG-3′（正向）和5′-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3′（反向）。HSP27 PCR反应总体积25μL。使用GeneAmp 2400热循环仪，预变性94℃5min，变性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，共35个循环，最后72℃延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳（110V，35mA，30min），溴化乙锭染色，BandScan 5.0软件进行电泳结果吸光度积分值分析，HSP27 mRNA表达相对含量值（灰度比）＝HSP27吸光度积分值／GAPDH吸光度积分值。

1.5 PC-3细胞免疫荧光染色 常规方法收获细胞，胰蛋白酶消化贴壁细胞，PBS冲洗后，TCM-N3冲洗，50mL锥形管2000 r／min离心10min。将上清液吸出并重新悬浮于1mL TCM-N3，滴于载玻片（多聚赖氨酸包被）上吹干，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤5min，共5次。滴加5 g／L BSA封闭液，37℃封闭30min，加入相应的一抗兔抗小鼠HMGBl抗体（1∶200），PBS洗涤5min，共5次。加入荧光标记的二抗PE标记的驴抗兔IgG（1∶500），避光，37℃孵育2 h，PBS洗涤5min，共5次。Hoechst 33342染料避光37℃孵育15min，PBS洗涤，共3次。缓冲甘油封片，荧光显微镜观察、拍照并保存。

1.6 TUNEL检测PC-3细胞凋亡 使用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测槲皮素对PC-3细胞凋亡的影响。将细胞用PBS冲洗，－20℃甲醇固定15min，然后PBS冲洗细胞3次，加入50μL TUNEL反应液，避光37℃孵育1 h。PBS冲洗细胞，Hoechst33258染料37℃染色10min。凋亡指数＝TUNEL阳性细胞数／细胞总数。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据分析。正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素对PC-3细胞HSP27 mRNA表达的影响 RTPCR检测结果显示，空白对照组和阴性对照组PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平明显升高，分别为128%和110%；给予槲皮素干预后，PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平明显降低，分别为50%和60%，并且槲皮素高剂量组降低更加明显，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图1）。

图1 槲皮素对PC-3细胞HSP27 mRNA表达的影响*P＜0.05，与对照组相比Fig.1 Effect of quereetin on the HSP27 mRNA expression*P＜0.05，compared with the control group

2.2 PC-3细胞免疫荧光染色结果 免疫荧光染色结果显示，空白对照组和阴性对照组HSP27阳性细胞染色强度明显高于槲皮素治疗组，并且槲皮素高剂量组HSP27阳性细胞染色强度降低更加明显（见图2）。

图2 PC-3细胞免疫荧光染色结果（×400）Fig.2 Immunofluorescent staining results of PC-3 cell（×400）

2.3 槲皮素对PC-3细胞凋亡的影响 槲皮素高剂量组和低剂量组可见大量凋亡PC-3细胞，且高剂量组高于低剂量组，呈剂量依赖性，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见图3）。

图3 槲皮素诱导PC-3细胞凋亡（SP，×200）*P＜0.05，与对照组相比Fig.3 PC-3 cell apoptosis induced by quereetin（SP，×200）*P＜0.05，compared with control group

3 讨论

HSP是应激条件下产生的高度保守的分子伴侣［9］，是组织和器官受到刺激或应激时表达的主要蛋白质，可参与细胞损伤、防御、修护产生而控制细胞功能［10］。HSP27作为小HSP亚家族中的重要一员，近年来研究HSP27与肿瘤的关系成为热点。正常组织细胞内HSP27的表达水平很低。应激状态可致胞内HSP27磷酸化并致其寡聚体解聚，HSP27表达上调，参与肿瘤的发生、侵袭以及转移过程［11］。本研究结果显示空白对照组和阴性对照组HSP27阳性细胞染色强度明显增高。研究结果与其相一致。

槲皮素是一种具有多种生物活性且无明显毒副作用的黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜及水果中，具有抗肿瘤、抗氧化、清除氧自由基、抗感染、抗血栓和抗病毒等多种活性，特别是抗肿瘤作用逐渐被人们所认识并引起广泛的重视［4，12］。然而槲皮素对前列腺癌的作用知之甚少。故此，本研究旨在讨论槲皮素对PC-3细胞HSP27 mRNA表达和凋亡的影响。结果发现，槲皮素可以抑制HSP27mRNA的表达，而且随着剂量增加，抑制作用增强，具有剂量依赖性。另外还发现，槲皮素对PC-3细胞增殖具有显著抑制作用。槲皮素抑制PC-3细胞HSP27mRNA的表达和诱导PC-3细胞凋亡可能是其抗前列腺癌的机制之一。

综上所述，PC-3细胞HSP27mRNA表达水平明显增高，而槲皮素可以抑制PC-3细胞HSP27mRNA表达，高浓度的槲皮素抑制作用更强，为寻找治疗治疗靶位奠定了基础。同时，槲皮素还诱导PC-3细胞凋亡，然而槲皮素诱导PC-3细胞凋亡的具体作用机制有待深入研究。

［1］刘世敏，李解方.HSP27在前列腺癌组织中的表达及其临床意义［J］.中南医学科学杂志，2013，41（3）：247-252.

［2］Fuller KJ，Issels RK，Slosman DO，et a1.Cancer and the heat shock response［J］.Eur JCancer.1994.30A（12）：1884-1891.

［3］Roeehi P，So A，Kojima S，et a1.Heat shock protein 27 inereases after androgen ablation and plays a cytoproteetive role in hormone refractory prostate cancer［J］.Cancer Res，2004，64（18）：6595-6602.

［4］舒博，张玲，牛越，等.前列腺癌组织Vitronectin表达临床意义研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2014，21（6）：447-450.

［5］何毅，张齐梅，章卓.槲皮素对人前列腺PC3细胞株增殖和凋亡影响［J］.泸州医学院学报，2013，36（4）：340-342.

［6］程健，李红军，许进秀，等.槲皮素对放射性肺损伤小鼠影响研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20（35）：1714-1719.

［7］苑辉卿，杨玲玲，姜安丽，等.槲皮素对前列腺癌细胞增殖及转录因子Spl功能的抑制作用［J］.中国生物化学与分子生物学报，2005，21（5）：673-678.

［8］方武，刘扬保，高淑华，等.槲皮素对前列腺癌细胞的放疗增敏性研究［J］.四川医学，2012，33（4）：591-593.

［9］李弘夏，谢智钦，杜立.基于HSP27的乳腺癌干细胞靶向治疗研究进展［J］.中国老年学杂志，2014，34（2）：561-563.

［10］Okazaki M，Shimizu Y，Chiba M.et al.Expression of heat shock proteins induced by cyclical tretching stress in human periodontal ligament fibroblasts［J］.Tohoku Univ Dent J，2000，19：108-115.

［11］李伟，江其生.热休克蛋白27与肿瘤关系的研究进展［J］.肿瘤研究与临床，2009，2 l（4）：430-431.

［12］李明，马建新，王忠明，等.槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞热休克蛋白表达的影响［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18（17）：1342-1344.

（编校：谭玲）（编校：吴茜，刘路路）

Effect of quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell

YU Feng，DIYan-cheng，JIANG Li-li

（Department of Urinary Surgery，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China）

ObjectiveTo evaluate the effectof quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell and discuss themechanism of quereetin on prostate cancer.MethodsHuman prostate cancer PC-3 cells were cultured and randomly divided into four groups：blank control group，negative control group（dimethylsulfoxide，DMSO group），high dose group（0.6 mg／mL quercetin 150μL），low dose group（0.3mg／mL quercetin 150μL）.RT-PCR and immunofluorescence staining were performed to detect the HSP27 mRNA expression，and the TUNEL staining was used to analyse the PC-3 cell apoptosis after quercetin treatment.ResultsRT-PCR results showed HSP27 mRNA expression was respectively 128%，110%，50%and 60%in four groups and displayed dose dependent manner.The difference between blank control group and quercetin treatment groups was statistically significant（P＜0.05）.Immunofluorescence staining showed quercetin could decrease the intensity of HSP27.TUNEL staining displayed large amountof apoptotic cells in quercetin treatment groups and showed dose dependentmanner.Compared with the blank control group，the differencewas statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Quercetin could inhibit PC-3 cell HSP27 expression and induce cell apoptosis，such effectsmay be onemechanism of its anti-prostate cancer.

quereetin；prostate cancer；heat shock protein 27；cell apoptosis

R585.5

A

1005－1678（2014）08－0047－03

于峰，男，硕士，主治医师，研究方向：泌尿外科疾病的基础与临床研究，E-mail：yufeng80＠126.com。