结直肠上皮内瘤变中LGR5的表达及其意义

肖幼华 李 荣 蔡联明 谢旭平 卢致洋 陈汉民 王冬梅 雷先华

结直肠上皮内瘤变是结直肠癌的癌前病变，是结直肠癌发生、发展中的一个病理阶段，是一个新的病理诊断名词，各级医院均已普遍使用这一诊断名词，其病变限于黏膜上皮或只侵犯固有膜而没有通过黏膜肌层到黏膜下层，无转移的危险。治疗方法主要是局部手术治疗。有文献报道，术前50%～90%的结直肠上皮内瘤变，术后被证实为结直肠癌，而结直肠癌，则需要采用根治性手术。本研究通过检测结直肠上皮内瘤，腺瘤及腺癌LGR5蛋白表达水平可将上皮内瘤变与腺癌区别开来，从而选择正确的外科治疗方法。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集赣州市肿瘤医院2011年-2012年住院及门诊病例，其中结直肠上皮内瘤变60例(腺瘤合并高级别上皮内瘤变32例，腺瘤合并低级别上皮内瘤变28例)其中有3例合并腺癌，男性46例，女性24例，年龄29～79岁，随机选取腺瘤10例，男性6例，女性4例，年龄37～69岁，均取自电切或手术切除标本。高分化腺癌20例，男性11例，女性9例，年龄30～70岁，均取自同期手术切除标本。各组临床病理资料经统计学检验无差异。

1.2 主要试剂

兔肠上皮干细胞蛋白单克隆抗体Anti- LGR5及SP-0023免疫试剂盒，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

厚4 μm 的石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精再水化。置CBS(pH6.0)高压热修复20 min，自然冷却，PBS冲洗3 次，每次3 min。加LGR5 一抗，37 ℃温箱孵育1 h。PBS 冲洗3 次，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS 冲洗3 次。DAB 显色，苏木精复染，封片，在显微镜下观察摄片。用PBS 代替一抗作为阴性对照，用经反复验证的已知阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果判断

LGR5以胞质呈棕黄色为阳性染色。高倍镜下(× 200)每张切片随机选择5 个视野，每个视野计数200 个肿瘤细胞，共1 000 个，计算阳性肿瘤细胞所占的百分数。肿瘤细胞无着色为(-)； 阳性细胞数< 25% 为(+)； 25%～50%为(++)；> 50%为(+++)。所有切片均由两位病理科医师采用双盲法做出判断。

1.5 统计学处理

应用SPSS 11.5统计分析软件包对数据进行分析。免疫组化检测数据行Fisher精确检验，Pearson Chi-square检验。以P<0.05为差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 各组织中LGR5表达情况

LGR5 免疫组化阳性产物主要分布于细胞质中，呈棕黄色细颗粒状，细胞核和细胞膜几乎不着色。结直肠腺瘤中LGR5阳性表达率为40.00%(4/10)，上皮内瘤变中其阳性表达率为83.33%(50/60)，腺癌为100.00%(20/20)，见表1。

表1 结直肠上皮内瘤变、腺瘤、腺癌中LGR5表达情况/例

2.2 LGR5表达与结直肠上皮内瘤变病理分级的关系

LGR5在高级别上皮内瘤变组和低级别上皮内瘤变组中阳性表达率分别为84.37%(27/32)、82.14%(23/28)，结果表明LGR5表达水平与结直肠上皮内瘤变病理分级无相关性(表2)。

表2 LGR5表达与结直肠上皮内瘤变病理分级的关系/例

3 讨论

LGR5(rich in leucine repeated units of G protein coupled receptor 5)属于G蛋白耦联受体家族，可在胃肠道、毛囊等多种组织表达。新近研究表明LGR5是Wnt通路的目标基因，与R-脊蛋白结合能够增强Wnt/B-catenin信号，进而促进结直肠癌的发生。研究发现LGR5表达阳性的干细胞是结直肠癌的起始细胞，作为潜在的结直肠干细胞标志物的LGR5在结直肠癌中大量表达[1-2]。结直肠癌发生的病理过程，是从腺瘤—上皮内瘤变—腺癌的过程，结直肠上皮内瘤变作为结直肠癌的癌前病变，是腺瘤转变为腺癌的一个重要环节。检测LGR5在结直肠癌不同病理阶段的表达，有助于结直肠癌的早期诊断[3]。

有资料表明LGR5可促进结直肠腺瘤的发生，从而促进腺瘤向上皮内瘤变，腺癌的转变[4-5]。Becker等[6]运用免疫组织化学的方法比较正常结肠、癌前病变以及结肠腺瘤LGR5的表达发现，正常的组织中LGR5在隐窝基底部表达，而在癌前病变的组织中LGR5的表达并不局限于隐窝基底部且表达量较高，结肠腺瘤中LGR5较少在基底部表达，而是在腺腔的表面大量表达.此研究表明LGR5是人肠道干细胞的一个潜在标志物，其失巢表达是干细胞向癌前病变转变的早期事件，并在肿瘤的发生中起重要作用。本研究中，在腺瘤，上皮内瘤变，腺癌当中均能检出LGR5，说明腺瘤，上皮内瘤变，腺癌的发生均来源于结直肠干细胞。

本研究还发现LGR5在腺瘤，上皮内瘤变，腺癌中的表达水平不一致。腺瘤表现为阴性和阳性，在上皮内瘤变表现阳性和中阳性，在腺癌中表现为中阳性和强阳性，有统计学意义。本研究中有3例上皮内瘤变标本取自距腺癌4～10 cm，均表现为中阳性，且腺癌组织表现为中阳性，两者完全吻合，说明这3例标本也已癌变。

有资料表明，术前50%～90%的结直肠上皮内瘤变，术后被证实为结直肠癌[7]。利用LGR5在腺瘤，上

皮内瘤变，腺癌中的表达水平不一致这一特点，我们可以用于上皮内瘤变的鉴别诊断，是上皮内瘤变，还时腺癌，为外科医生选择手术方式提供依据。本研究中10例LGR5表达阴性及30例表达阳性者，均为上皮内瘤，手术采取电切术，局部切除术。18例表达中阳性者，有9例是腺癌，50%的中阳性患者需行根治性手术，还有50%的中阳性患者则需肠段切除术。许多研究表明LGR5在癌组织及癌旁组织大量表达[1]，对于结直肠上皮内瘤变中LGR5表达中阳性者，就给予肠段切除或根治性手术。高级别上皮内瘤变中，1例表达为强阳性者，经局部切除后，术后病理诊断为腺癌，而行二次手术。低级别上皮内瘤变中，1例表达强阳性者，术前为腺瘤，行局部切除，术后为低级别上皮内瘤变，术后8个月，转变为直肠癌，而行Miles手术。

综上所述，对于术前病理诊断为结直肠上皮内瘤变，加做LGR5检测，根据LGR5表达水平不同，可以鉴别是瘤变，还是腺癌，LGR5是鉴别结直肠上皮内瘤的良好的免疫组化指标，为选外科手术方式提供重要的参考依据，避免了行二次肠镜，二次病理活检，二次手术。

[1] 陈小燕，赵 逵.LGR5与结肠癌关系的研究进展〔J〕.世界华人消化杂志，2013，21(8)：673-678.

[2] Takahashi H，Ishii H，Nishida N，et al.Significance of LG-R5(+ve)cancer stem cells in the colonand rectum〔J〕.Ann Surg Oncol，2011，18(4)：1166-1174.

[3] 郝艳平，胡顺明，张世栋，等.干细胞标记物LGR5在结直肠癌发生发展中的表达及意义〔J〕.山东大学学报(医学版)，2009，47(8)：85-88.

[4] Takeda K，Kinoshita I，Shimizu Y，et al.Expression of L-GR5，an intestinal stem cellmarker during stage of colorectal tumorgenesis〔J〕.Anticancer Res，2011，31(1)：263-270.

[5] Al-Kharusi MR，Smartt HJ，Greenhough A，et al.LGR5 promotes survival in human colorectal adenoma cells and is upregulated by PGE2：implications for targeting adenoma stem cells with NSAIDs〔J〕.Carcinogeesis，2013，34(5)：1150-1157.

[6] Becker L，Huang Q，Mashimo H.Immunostaining of LGR5，an intestinal stem cell marker，in normal and premalignant human gastrointestinal tissue〔J〕.Scientific World Journal，2008，8：1168-1176.

[7] 肖幼华，蔡联明，李 荣，等.结直肠上皮内瘤变18例临床分析〔J〕.实用癌症杂志，2012，27(6)：622-623，626.