MCM2基因和蛋白在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

程甜甜 杨贤子 骆志国

MCM2属于微小染色体维持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins，MCMs)的成员之一。MCM2蛋白与其他家族成员形成复制前复合物可作为DNA复制的“通行证”，在所有真核细胞的DNA复制中起到重要作用[1]。我们前期的研究发现MCM2作为细胞增殖特异性标志优于常见的细胞增殖指标Ki-67，能够更客观和全面的反映肿瘤细胞的增殖状态[2]。本研究通过检测乳腺癌组织中MCM2 mRNA和蛋白水平的表达变化，进一步探讨其在乳腺癌发生发展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

所有标本随机取自2012年03月1日-2013年05月1日湖北省十堰市太和医院乳腺外科住院患者的手术切除组织。全组病例均经病理检查确诊，其中乳腺恶性肿瘤54例，乳腺良性疾病12例，以乳腺良性疾病手术切除的正常乳腺组织(10例)作为对照组。54例乳腺恶性肿瘤包括35例浸润性导管癌、6例乳腺导管内癌、2例乳腺小叶原位癌、3例髓样癌、5例单纯癌、其他3例。其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。12例乳腺良性疾病包括乳腺纤维腺瘤、乳腺腺病、乳腺囊性小叶增生，患者术前均未行放疗、化疗、激素和中草药物等治疗。手术标本于-80℃冻存。

1.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同乳腺癌组织MCM2mRNA的表达

所有PCR引物均用Primer Premier 5.0软件设计，引物序列由上海生工生物工程公司合成。MCM2引物序列上游：5’-CACGCTTTGACATCCTGTG-3’；下游：5’-TGTTGATCTGACGAGCCTTA-3’，PCR产物大小为657 bp。GAPDH引物序列上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；引物下游：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，PCR产物大小为113 bp。分别称取0.1 g的正常乳腺组织、乳腺良性疾病组织和乳腺癌组织，用匀浆器将组织碾磨碎后按照Trizol试剂(MRCGENE公司)说明书提取组织总RNA，紫外分光光度法检测RNA纯度和浓度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套试剂盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。PCR扩增条件为：95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 30 s，共30个循环。取10 μl的扩增产物在EB染色的2%琼脂糖凝胶中电泳。用凝胶成像扫描分析系统(英国Syngene公司的GeneGenius)测定所有条带，应用GeneTools软件分析所有条带各自峰面积值,定义为该条带的吸光度值(OD)。以GAPDH为内参照基因，MCM2基因mRNA的相对表达量则用MCM2基因(T)与内参照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD ratio)表示。MCM2基因mRNA检测经历3次独立性重复检测。

1.3 Western blotting检测MCM2蛋白的表达

用总蛋白提取试剂盒(Applygen公司)提取所有标本的总蛋白。简而言之，将0.1 g的所有标本剪碎后加入1 ml裂解液，然后放入匀浆器将组织碾磨均匀。取0.5 ml组织匀浆液转移到1.5 ml离心管。每0.5 ml组织匀浆液加入2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4 ℃静置10 min后，4℃下10 000 r/min离心10 min，弃去上下层液体，无水乙醇洗涤中层蛋白膜后溶于4℅ SDS，使用BCA法蛋白含量测定试剂盒(Pierce,Rockford,IL,USA)检测提取的蛋白浓度。取等量的蛋白(25 μg)上样于12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶，经电泳分离后，电转移至PVDF膜上。封闭后加入抗MCM2的一抗(美国Santa Cruz公司，按1∶300稀释)在4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，用DAB试剂盒(北京中杉生物技术公司)显影。MCM2蛋白检测经历3次独立的重复性检测。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，组间比较采用独立样本的t检验(independent sample t-test)和单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05判定差异有统计学意义。统计数据用均数±标准差(M±SD)表示。

2 结果

2.1 正常乳腺组织和良、恶性乳腺肿瘤组织中MCM2 mRNA和蛋白的表达

与正常的乳腺组织相比，良、恶性乳腺肿瘤组织中MCM2 mRNA和蛋白的表达水平均增高，具有统计学差异(P<0.01)。RT-PCR和Western-blotting检测结果发现，良性和恶性乳腺肿瘤组织之间MCM2 mRNA和蛋白的表达水平也存在统计学差异(P<0.05)。

2.2 MCM2表达与乳腺癌组织临床分期的关系

由图1和图2中可以看出，不同TNM分期的乳腺癌组织中MCM2表达存在着差异。其中Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌组织MCM2 mRNA和蛋白的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌组织(P<0.05)，见表1。而Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅳ期乳腺癌组织间MCM2的表达量无统计学差异(P>0.05)，见表1。

1为Marker；2为H2O对照；3为正常乳腺组织；4为乳腺良性疾病组织；5为Ⅰ期乳腺癌组织；6为Ⅱ期乳腺癌组织；7为Ⅲ期乳腺癌组织；8为Ⅳ期乳腺癌组织。

1为正常乳腺组织；2为乳腺良性疾病组织；3为Ⅰ期乳腺癌组织；4为Ⅱ期乳腺癌组织；5为Ⅲ期乳腺癌组织；6为Ⅳ期乳腺癌组织。

表1 不同TNM分期乳腺癌组织中MCM2基因mRNA的相对表达量(M±SD)

注：mRNA相对表达量为目的基因光密度(OD)与GAPDH光密度(OD)之比率。

2.3 MCM2表达与乳腺癌组织临床病理特征的关系

由图3和图4可见，低、中、高分化乳腺癌组织中MCM2 mRNA和蛋白的表达量存在统计学差异(P<0.05)。其中，低分化乳腺癌组织中MCM2 mRNA和蛋白的表达量较高分化的增高(P<0.01)，见表2和图4。

表2 不同分化程度乳腺癌组织中MCM2基因mRNA的相对表达量(M±SD)

注：mRNA相对表达量为目的基因光密度(OD)与GAPDH光密度(OD)之比率。

1为Marker；2为H2O对照；3为正常乳腺组织；4为乳腺良性疾病组织；5为高分化乳腺癌组织；6为中分化乳腺癌组织；7为低分化乳腺癌组织。

1为正常乳腺组织；2为乳腺良性疾病组织；3为低分化乳腺癌组织；4为中分化乳腺癌组织；5为高分化乳腺癌组织。

3 讨论

2012年中国肿瘤登记中心发布最新数据指出乳腺癌是我国女性排名第一位的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，尤其是在城市。随着医疗水平的进步，虽然我国乳腺癌的治愈率和5年生存率明显提高，但乳腺癌的早期诊断仍不理想。因早期的肿瘤细胞增殖能力较强，故肿瘤的早期诊断主要通过对其相关的增殖标志物来判断。目前临床上常用的乳腺癌增殖标志物包括PCNA、Ki-67等。MCM蛋白家族是真核生物DNA复制的必需因子，在DNA复制起始和延伸过程中起到关键性作用[3]。Osaki等研究发现：与常用的增殖指标PCNA和Ki-67蛋白相比，MCM2蛋白能够更敏感而更特异地反映细胞的增殖情况[4]。随后国内外的研究发现，MCM2蛋白能够较好的区分正常组织、不典型增生组织和肿瘤组织，可以作为结直肠癌、肝细胞肝癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的重要生物学标志，在判断肿瘤的恶性度及评估预后方面具有重要意义[2,5-7]。

我们前期使用免疫组化S-P法，得出MCM2在乳腺癌中的表达主要在细胞核内。MCM2在乳腺癌不同TNM分期、不同病理组织学分级(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及淋巴结转移之间均有显著性差异，且呈逐渐升高趋势。MCM2和Ki-67在乳腺癌中的表达呈平行关系(P<0.001)，且作用优于Ki-67[2]。本研究发现，MCM2在乳腺癌mRNA和蛋白水平的表达均较高，这与我们在免疫组化中得到的结果一致。这一现象提示MCM2的表达过量可能导致正常乳腺细胞不断进入细胞周期，反复启动DNA复制和延伸，从而使DNA突变率增加，最终导致乳腺细胞发生癌变。同时，MCM2 mRNA和蛋白的表达量在乳腺癌不同的TNM分期和不同的病理类型之间存在着统计学的差异(P<0.05)，但在Ⅰ期和Ⅱ期之间、Ⅲ期和Ⅳ期之间MCM2的表达却无统计学差异(P>0.05)。这提示MCM2可能对反映乳腺癌细胞恶性程度和异常分化有重要的参考价值，从而可用来判断临床治疗和预后评估等。

本研究结果从mRNA和蛋白表达水平上再次证实MCM2可能与乳腺癌的发生发展密切相关，对癌前病变、恶性程度及预后判定具有一定的临床意义。进一步深入研究MCM2表达调控在乳腺癌发生发展的机制，可能找到预防和治疗乳腺癌的方法。MCM2可能成为乳腺癌基因治疗一个新的潜在分子靶点。

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