肝癌细胞中SPARC表达及其与糖酵解作用的相关性

华红伟 姜 峰 胡薇薇 李 静 丁 罡

分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protien acidic and rich in cysteine,SPARC)是细胞外基质非胶原糖蛋白中的1种钙结合蛋白，也称骨连接蛋白(osteonectin)[1]。SPARC基因定位于人类染色体5q31.3-q32[2]，编码由298-304个氨基酸组成的蛋白质。SPARC蛋白参与多种生物学过程，包括胚胎发育，成骨组织形成，伤口愈合及组织重建等[3]；同时，与肿瘤的发生发展也密切相关，主要涉及新生血管的形成[4]，调控细胞周期，调节细胞的粘附作用[5]等过程，但SPARC与肿瘤细胞糖酵解之间的调节关系及作用机制目前尚未见报道。

糖酵解作用中己糖激酶(hexokinase 2,HK)是第一个限速酶，当细胞中HK活力增强时，6-磷酸葡萄糖增加，为糖酵解提供充足的碳源和能源[6]；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase-A,LDHA)是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸转化为乳酸，LDHA在多种肿瘤中高表达，提示LDHA与肿瘤的发生发展有密切的关系。本研究以肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh7为研究对象，观察SPARC表达与HK-Ⅱ及LDHA活性之间的相互作用关系，初步探究SPARC与糖酵解作用之间的相互关系及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

本实验选取HepG2、Hep3B、Huh7人肝癌细胞作为研究对象，购自于美国菌种保藏中心细胞库(ATCC)。细胞株培养于含5%二氧化碳、温度为37.5 ℃、饱和湿度的培养箱中，所用DMEM培养液中加入10%胎牛血清及青-链霉素双抗(penicillin-streptomycin,PS)。

1.2 主要试剂及耗材

SPARC质粒及siRNA购自于北京傲锐东源生物科技有限公司；Oligofectamine、pti-MEM®I 低血清培养基购自于Invitrogene 公司；乳酸脱氢酶活性检测试剂盒购自于BioVision公司；己糖激酶比色检测试剂盒购自于Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 质粒/siRNA的转染 转染前一天取出对数生长期的细胞，以每孔3-5×105密度接种于6孔细胞培养板上，当细胞融合率在70%～80%时进行转染实验；将浓度梯度为2 μg/ml，4 μg/ml，6 μg/ml的质粒分别加入Opti-MEM I低血清培养基，共100 μl轻轻摇匀；以Oligofectamine作为转染载体，按照质粒(μg)：Oligofectamine(μl)=1∶2的比例加入Oligofectamine，用Opti-MEM I 低血清培养基稀释，总体积为100 μl，在室温下孵育5 min；将上述两种混合物混合(共200 μl)，室温下孵育30 min，直到质粒：Oligofectamine复合物形成；将复合物加入到细胞培养板中，37 ℃、CO2培养箱孵育8 h。24 h后换液，再过24 h收集细胞评估转染效率，并筛选出最佳质粒浓度。

1.3.2 比色法检测HK/LDHA活性 检测前一天，将转染后的细胞以2×105/孔密度接种于24孔板中；弃去原培养液，PBS漂洗细胞2次，将细胞培养板用多孔板离心机400 r/min离心5 min,吸去上清液；加入用PBS稀释10倍后的试剂盒提供的HK/LDHA释放试剂150 μl,适当摇晃混匀，在细胞培养箱中孵育1 h；应用己糖激酶检测试剂盒/乳酸脱氢酶检测试剂盒，按照说明书方法通过一系列HK/LDHA标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线，应用酶标仪分别在563 nm及490 nm处检测吸光度(OD值)，间接反映HK,LDHA活性的变化。每个样品重复测定3次。

2 结果

转染SPARC质粒的肝癌细胞中HK的活性与对照组相比明显下降，HepG2/Hep3B/Huh7 3种肝癌细胞中HK-Ⅱ的相对吸光度分别降低至(57.45±5.05)%、(56.1±5.70)%、(49.73±7.06)%，P<0.05)；反之，siRNA抑制SPARC表达后的细胞中，3种细胞中HK-Ⅱ的相对吸光度分别上调至(174.20±8.41)%、(166.69±9.71)%、(152.84±3.39)%，有显著性差异(P<0.05)(图1，表1)。

转染SPARC质粒的肝癌细胞中LDHA的活性与对照组相比明显下降，HepG2/Hep3B/Huh7 3种肝癌细胞中LDHA的相对吸光度分别降低至(50.53±8.07)%、(54.38±2.08)%、(42.34±3.44)%；反之，siRNA抑制SPARC表达后的HepG2细胞中，LDHA的活性较对照组明显上调，3种肝癌细胞中LDHA的相对吸光度分别上调至(176.65±6.85)%、(163.24±6.44)%、(151.25±6.75)%，有显著性差异(P<0.05)(图2，表2)。

3 讨论

SPARC具有多种生物学功能，在多种肿瘤中，如乳腺癌[7]、神经胶质瘤[8]、黑色素瘤[9]中均表现为高表达，它与肿瘤的发生、侵袭、转移等病理过程密切相关[10]，在肿瘤发生发展中的作用及对肿瘤信号传导通路的调节功能较复杂，并且具有组织特异性，目前的研究主要集中于SPARC对肿瘤新生血管形成、EMT转变、相关生长因子及受体表达、以及蛋白水解酶表达等调节作用方面[11]。糖酵解代谢是恶性肿瘤细胞获取能量的主要来源，肿瘤细胞糖酵解活跃程度与肿瘤生长速度和侵袭性有密切关切，但SPARC与糖酵解作用的相互关系研究较少。

本研究以肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh7为研究对象，分别转染SPARC与siRNA SPARC，以促进SPARC高表达或抑制SPARC基因的表达，应用比色法检测在SPARC不同表达水平时，糖酵解关键酶HK-Ⅱ与LDHA的活性变化，观察SPARC与这两种糖酵解关键酶活性之间的相互关系，初步探究了肿瘤细胞中SPARC表达与糖酵解作用是否关联。实验结果显示，SPARC过表达的细胞中，HK-Ⅱ、LDHA的活性明显下调，而当应用siRNA抑制SPARC表达时，HK-Ⅱ、LDHA的活性明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示肝细胞癌中，SPARC的表达水平与细胞糖酵解作用相互关联，SPARC通过负性调控糖酵解作用的关键酶HK-Ⅱ、LDHA参与介导肝癌细胞的糖酵解作用，进而影响肿瘤的发生发展，而Le Bail 等的报道显示SPARC在肝细胞癌的基质中呈高表达水平，并与肝癌的恶性程度有关[12]，陈科济等[13]利用RT-PCR技术分别检测 62 例HCC及相应癌旁组织标本、30例正常肝组织标本中 SPARC mRNA 的表达，结果显示SPARC 在HCC癌组织中表达上调，在正常肝组织中低表达，因此SPARC在肿瘤细胞中表现出促癌或抑癌作用还有待进一步明确，同时相关生物学作用是否与肝癌细胞的类型、不同肿瘤的病理类型、肿瘤分期相关尚未清晰。同时，目前另有研究表明，SPARC与AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protiein kinase,AMPK)信号传导通过具有相互调节作用，AMPK作为能量代谢变化的感受器，能够被ATP/AMP的比值变化所激活，SPARC通过AMPK信号通路参与调控细胞的糖酵解过程[14]，因此，结合本研究结果，SPARC、糖酵解关键酶及AMPK信号通路之间是否存在相互调节作用还有待深入探究。

图1 HepG2/Hep3B/Huh7细胞分别转染SPARC或siRNA SPARC后HK相对活性的变化

表1 HepG2/Hep3B/Huh7细胞分别转染SPARC或siRNA SPARC后HK在563 nm处的OD值，(X±SEM，%)

*为与对照组比较，P<0.05。

图2 HepG2/Hep3B/Huh7细胞中分别转染SPARC或siRNA SPARC后LDHA的相对活性

表2 HepG2/Hep3B/Huh7细胞分别转染SPARC或siRNA SPARC后LDHA在490 nm处的OD值(X±SEM，%)

*为与对照组比较，P<0.05。

综上，本研究发现在肝细胞癌中SPARC通过负性调节糖酵解关键酶影响细胞的糖酵解过程，在下一步研究中，我们将在不同类型的肝癌细胞系及肝癌组织样本中，进一步探究SPARC表达与糖酵解的作用机制，为抑制肝细胞癌的发展机制研究提供了新的思路。

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