CIK联合DDP对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应

徐 梅 张 蓓 尹凤玲 成 杰 刘 洋 李 丹 蒋敬庭 吴昌平

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其组织类型繁多，约85%～90%为上皮性卵巢癌。随着免疫细胞生物学、免疫学、分子生物学的飞速发展，免疫治疗(特别是细胞过继性免疫治疗)已成为继肿瘤患者手术、化疗、放疗后辅助治疗的重要手段之一[1]。本研究目的是探讨CIK细胞是否增强化疗药顺铂DDP对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤活性，为卵巢癌综合治疗新策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

①淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液研究所)；②COBE spectra 型血细胞分离机(Gambro BC公司)；③流式细胞分析仪EPICS XL(美国贝克曼库尔特公司)；④鼠抗人CD3McAb(美国Antihody Diagnostica Inc公司)；⑤基因重组人IL-2(山东泉港药业有限公司)；⑥重组人IFN-γ(上海克隆生物高技术有限公司)；⑦重组人IL-1α(美国Pepro Tech EC Ltd公司)；⑧鼠抗人CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三标记抗体，CD3-FITC/CD16CD56-PE双标记抗体，同型对照IgG1FITC/IgG1PE/IgG1PE-Cy5IgG1FITC/IgG1PE，IgG1

-PE，IgG1-PC5：(美国Beckman Coulter公司，苏医生物基因公司)；⑨ANNEXIN V-FITC凋亡检测试剂盒(碧云天生物公司)；⑩顺铂注射液(批号：130302 江苏豪森药业股份有限公司)。

1.2 效应CIK细胞的制备和免疫表型分析[2]

用淋巴细胞分离液密度离心提取O型健康者单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至2×106/ml，第1天加入IFN-γ(1.5×106U/L)，置入37℃、5%CO2培养箱中，24 h后加入CD3 McAb (100 μg/L)、IL-2(5.0×105U/L )和IL-1α(1.0×105U/L)，以后每2～3天添加一次培养液，同时补加IL-2(5.0×105U/L)，于培养第1、7、14天收取CIK细胞，分别加入抗CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三标抗体和抗CD3-FITC/CD56-PE双标抗体混匀，4℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测CIK细胞表型变化，测定CD3+CD56+双阳性细胞百分比。

1.3 卵巢癌细胞株的培养

SKOV-3细胞株购自上海中国科学院细胞库，冻存于-196℃液氮中，由我院中心实验室传代培养，培养于改良RPMI-1640完全培养基。

1.4 流式细胞仪检测CIK培养上清液对SKOV-3细胞的凋亡作用

选取培养l4天的CIK细胞，更换培养液，培养48 h后，1 500r/min，离心5 min，留取CIK细胞培养的上清液，以1∶1的比例混合新鲜改良RPMI-1640培养液培养SKOV-3细胞，培养24 h、48 h收集细胞，以未加CIK培养液上清的SKOV-3细胞作为对照组。按照Annexin V-FITC试剂盒说明结合流式细胞仪检测凋亡情况。

1.5 MTT法测定CIK细胞和DDP对SKOV-3细胞的杀伤效应

取培养第14天收获的CIK细胞作为效应细胞，对数生长期的SKOV-3细胞作为靶细胞。调整靶细胞浓度为1.0×105/ml，加入96孔平底培养板，100 μl/孔。次日细胞贴壁后按不同组别给予相应处理：A1～4CIK作用组，按效靶比不同(A1组5∶1、A2组10∶1、A3组20∶1、A4组40∶1)加入不同浓度的CIK细胞100 μl；B1～7DDP作用组分别加入用完全培养基配制的不同浓度DDP100 μl (其作用浓度分别为：B1组0.625、B2组1.25、B3组2.5、B4组5、B5组10、B6组20、B7组40 μg/ml)；C1～2CIK联合DDP作用组先给予DDP(浓度2.5 μg/ml)作用4 h后，分别按效靶比为5∶1和10∶1加入不同浓度CIK细胞。同时设单独靶细胞及不同浓度效应细胞做对照孔，每组设6个复孔，置于37 ℃、5%CO2孵箱中分别于培养24 h、48 h后，每孔加MTT 20 μl (5 mg/ml)，继续培养4 h，平板离心机1 500 r/min离心10 min，小心弃去上清液，每孔再加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μl，轻轻振荡10 min以溶解形成的色素颗粒，用酶联免疫检测仪检测λ=492 nm波长处的吸光度(A值)。按下列公式计算抑制率：抑制率 (%)=[1-(实验孔A值-效应细胞A值)/靶细胞A值]×100%或抑制率(%)= (1-实验孔A值/靶细胞A值)×100%

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 CIK细胞表型分析和扩增[2]

CD3+CD56+双阳性CIK细胞在第1、7、14天所占比例分别为(0.7±0.4)%、(11.5±0.9)%及(31.6±5.5)%。随着培养时间延长，CD3+CD56+双阳性CIK细胞表达的比例逐渐增加，本实验选用培养第14天的CIK细胞，流式细胞仪检测其CD3+CD56+细胞比例达38.7%，见图1。说明CIK细胞可通过体外培养获得大量增殖。

图1 培养第14天CD3+CD56+CIK细胞表型变化

2.2 流式细胞仪检测CIK培养上清液诱导SKOV-3细胞凋亡情况

Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色后，正常的活细胞不会被染色(FITC-/PI-，图2左下象限)，凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色(FITC+/PI-，图2右下象限)，凋亡晚期和坏死细胞会被Annexin V-FITC和PI双染(FITC+/ PI+，图2右上象限)。本实验组24 h 及48 h凋亡率分别为(12.63±0.95)%和(27.13±2.03)%，其差异有统计学意义(P<0.01)。表明在一定时间内，随着作用时间的延长凋亡率不断增高。

图2 SKOV-3细胞与CIK培养上清液共培养后凋亡情况

2.3 MTT法检测不同因素对SKOV-3生长抑制情况见

在相同作用时间时，CIK、DDP及其联合治疗各小组间抑制率存在显著性差异(P<0.05)，除DDP 0.625 μg/ml组24 h和48 h抑制率差异无显著性(P=0.102)，其余各组不同时间抑制率存在显著性差异 (P<0.05)，随着作用时间延长，其细胞抑制作用明显增强。联合用药组与单一因素处理组组间比较差异存在显著性 (P<0.05)。见表1。

3 讨论

CIK细胞是由Schmidt Wolf等在1991年首先报道。其是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、γ-IFN等)共培养后获得的一群异质细胞群。CD3+CD56+细胞是CIK细胞中的主要效应细胞，既有T淋巴细胞强大的抑瘤活性，又具有NK细胞非MHC限制性杀瘤优点，故又称为NK细胞样T淋巴细胞[3-4]。CIK细胞与LAK细胞、CD3AK细胞相比具有增殖快、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞同样敏感的特点[5]，被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方法。CIK治疗已被应用于肿瘤患者的临床治疗(如白血病[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]等)并取得较好的杀瘤效果。

研究结果[2]显示，起初CD3+CD56+细胞比例为(0.7±0.4)%，第14、21天分别增为(31.6±5.5)%

表1 CIK或(联合)DDP对SKOV-3细胞的杀伤作用

注：①A1～4CIK治疗组：CIK与SKOV-3效靶比依次为5∶1、10∶1、20∶1、和40∶1；②B1～7DDP治疗组：DDP浓度依次为0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/ml；③C1～2联合治疗组：DDP浓度均为2.5 μg/ml，CIK与SKOV-3效靶比分别为5∶1和10∶1。

和(35.8±9.7)%，扩增倍数可达35～52倍。动态分析其表型特征发现，第14～21天为CD3+CD56+细胞高表达的平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞，进一步临床研究发现，增加CIK细胞输注的频次可明显降低胃癌患者的死亡风险[7]。本实验选择体

外培养14天的CIK细胞，流式细胞检测其CD3+CD56+细胞所占比例达到38.7%。杀伤实验结果显示，当效靶比为5∶1时，24 h和48 h的杀伤率分别为(16.52±2.52)%和(24.20±5.59)%。当效靶比增为40∶1时，其24 h和48 h的杀伤率分别为(53.98±5.02)%和(74.74±6.87)%，说明CIK细胞对SKOV-3卵巢癌细胞具有较强的杀伤作用，并且，随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒性明显增强。顺铂是卵巢癌经典的一线化疗药物，本研究中，当顺铂浓度为2.5 μg/ml时，48 h对SKOV-3的抑制率为(46.04±2.76)%，联合5∶1和10∶1 CIK细胞共培养48 h后细胞抑制率分别为(69.87±2.67)%和(80.11±2.73)%。这说明随着CIK细胞浓度的增加及作用时间的延长，细胞抑制率明显增高。常规化疗联合CIK治疗具有协同抗肿瘤效应。

CIK细胞对肿瘤细胞发挥杀伤作用的机制可能有以下几点：①与靶细胞结合并释放穿孔素及颗粒酶对靶细胞发挥杀伤作用。②产生大量细胞因子(如γ-IFN，TNF-α，IL-2等)作用于肿瘤细胞。③调节免疫系统发挥间接杀伤作用。研究[10]发现，肿瘤患者在经过CIK细胞治疗后，其外周血中CD4+CD25+调节T细胞(Treg)比例较治疗前明显降低，说明CIK治疗可以在一定程度上提高患者的免疫功能。④诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。Shan等[11]用Curcumin可提高靶细胞及CIK细胞表面Fas-FasL蛋白的表达而发挥促进凋亡作用。另有研究[12-13]发现，CIK细胞是通过下调凋亡抑制基因Bcl-2或上调促凋亡基因Bax蛋白表达来诱导肿瘤细胞凋亡。本实验采用CIK培养液上清和SKOV-3细胞共培养，随后24 h和48 h凋亡检测结果显示细胞凋亡和坏死率逐渐增加，说明CIK可产生杀伤因子并通过诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡而发挥杀伤作用。

卵巢癌位于盆腔，其转移和复发具有局限于腹腔内的特点，自体CIK 细胞无免疫源性，应该比较适合于腹腔灌注治疗。CIK治疗可为无法手术又难以耐受放化疗的晚期卵巢癌患者提供治疗策略。对延长此类患者生存期、改善其生存质量，具有非常重要的意义。

[1] Jiang J,Wu C,Lu B.Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity〔J〕.J Transl Med,2013,11:83-83.

[2] 吴昌平,蒋敬庭,邓海峰,等.CIK细胞体外培养的免疫表型〔J〕.江苏医药,2005,31(9):644-645.

[3] Pievani A,Borleri G,Pende D,et al.Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells,a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity〔J〕.Blood,2011,118(12):3301-3310.

[4] Mesiano G,Todorovic M,Gammaitoni L,et al.Cytokine-induced killer (CIK) cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2012,12(6):673-684.

[5] Schmidt-Wolf IG,Lefterova P,Johnston V,et al.Sensitivity of multidrug-resistant tumor cell lines to immunologic effector cells〔J〕.Cell Immunol,1996,169(1):85-90.

[6] Wang Y,Bo J,Dai HR,et al.CIK cells from recurrent or refractory AML patients can be efficiently expanded in vitro and used for reduction of leukemic blasts in vivo〔J〕.Exp Hematol,2013,41(3):241-252.

[7] Jiang JT,Shen YP,Wu CP,et al.Increasing the frequency of CIK cells adoptive immunotherapy may decrease risk of death in gastric cancer patients〔J〕.World J Gastroenterol,2010,16(48):6155-6162.

[8] Wang YY,Wang YS,Liu T,et al.Efficacy study of Cyber-

Knife stereotactic radiosurgery combined with CIK cell immunotherapy for advanced refractory lung cancer〔J〕.Exp Ther Med,2013,5(2):453-456.

[9] Ma Y,Xu YC,Tang L,et al.Cytokine-induced killer (CIK) cell therapy for patients with hepatocellular carcinoma:efficacy and safety〔J〕.Exp Hematol Oncol,2012,1(1):11.

[10] 李 敏,邓海峰,陆明洋,等.CIK治疗前后肿瘤患者外周血CD4+CD25+调节型T细胞变化研究〔J〕.中国实验诊断学,2011,15(6):1051-1053.

[11] Shan YH,Cui LF,Cui MH.Pro-apoptotic effects of curcumin associated with CIK cells against ovarian carcinoma cells〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2013,93(5):385-388.

[12] Li XD,Sun S,Song LL,et al.The cytotoxicity and mechanism of CIK cells to breast cancer cells ZK-75-1 〔J〕.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2006,22(3):314-317.

[13] Sun S,Li XM,Li XD,et al.Studies on inducing apoptosis effects and mechanism of CIK cells for MGC-803 gastric cancer cell lines〔J〕.Cancer Biother Radiopharm,2005,20(2):173-180.