CXCL12蛋白表达在鼻咽癌组织中的临床意义

罗庆丰 李金高 张小芳 付爱荣 齐淑轶 黄先明 张 科

鼻咽癌是常见多发的恶性肿瘤,放化疗综合治疗是近期主要的治疗方式,失败的主要原因是局部复发，我们通过研究鼻咽癌的患者肿瘤局部的免疫状态，探索肿瘤复发机制，预测肿瘤的预后因子，降低复发的发生率，提高患者的生存质量和生存时间，改善治疗效果，为鼻咽癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2006年3月-2007年5月收集98例在江西省肿瘤医院院治疗的鼻咽癌患者，其中男性54例，女性44例，年龄27～70岁，中位年龄56岁；患者均经病理检查证实为鼻咽非角化癌，收集患者5年随访资料。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 试剂 CXCL12蛋白单克隆抗体(即用型)及MaxvisionTM免疫组化试剂盒购自英国Abcam公司，CXCL12蛋白为工作液，参考滴度1∶100。

1.2.2 方法 CXCL12蛋白标记检测采用MaxvisionTM免疫组化法，操作按说明书进行：① 4 μm连续切片，裱于涂有APES的载玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；③ 3%过氧化氢室温孵育30 min，消除内源性过氧化物酶；④ 抗原修复：切片浸于pH 6.0柠檬酸溶液中，电饭锅中煮沸5 min，保温10 min，自然冷却；⑤ PBS洗,3 min×2次；⑥ 加入CXCL12抗体，4 ℃冰箱12 h；⑦ 复温，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧ 滴加Maxvision试剂，室温作用1 h；⑨ PBS洗3 min×2次；⑩ DAB光镜下显色，苏木精复染，封片。光镜下观察CXCL12蛋白在鼻咽癌组织中表达。阳性对照：购自英国Abcam公司CXCL12蛋白乳腺癌阳性组织片。阴性对照：PBS代替一抗。

1.2.3 结果判断 细胞胞质呈棕黄色颗粒沉着者为CXCL12蛋白阳性表达。选择CXCL12蛋白阳性表达热点区的4个高倍视野，记数400个以上细胞，根据阳性细胞数及细胞染色强度进行半定量，根据着色强度及显色癌细胞比例将染色结果分为-、+、++和+++。染色强度评分方法为：无着色计0分；染色为浅棕色计1分;染色为棕色计2分;染色为棕褐色计3分。阳性细胞百分比:无阳性细胞计0分;阳性细胞数<10%计1分;10%～<50%计2分;50%～<75%计3分;≥75%计4分。由两名病理科医师独立阅片完成,核对结果,取得共识。上述两项结果之乘积为最后评分结果，结果分为：①阴性表达，<4分为(-);②阳性表达，≥4～<6分为(+),≥6～<9分为(++),9≥～<12分为(+++)。

1.3 治疗方法

按国际抗癌联盟 UICC 2003 版鼻咽癌分期标准对患者进行临床TNM分期，根据分期结果确定治疗方案。放射源为直线加速器治疗机，采用常规分割方法。98例均完成同期化疗和放射治疗，放疗剂量为鼻咽部66～72 Gy/33～36次/7～8周，颈部转移淋巴结60～70 Gy/30～35次/7～8周，颈部的预防照射剂量46～50 Gy/23～25次/5～6周。同期采用PF方案化疗：顺氯氨铂20 mg/m2和5-氟尿嘧啶500 mg/m2，静脉滴注，连用5天。

1.4 疗效评价方法

应用WHO实体瘤近期疗效评定标准，放疗结束时根据CT检查结果评价即时疗效，分为CR和PR。

1.5 统计方法

应用SPSS 16.0统计软件进行分析， 生存率采用Kaplan-Meier分析。

2 结果

2.1 CXCL12蛋白表达与鼻咽癌临床病理特征的关系

CXCL12蛋白表达与鼻咽癌病理组织亚型无相关性，CXCL12蛋白表达与淋巴结转移密切相关，淋巴结转移患者CXCL12阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P<0.05)；CXCL12蛋白表达与鼻咽癌TNM及治疗疗效显著相关(P均<0.05)，见表1。

表1 CXCL12蛋白表达与鼻咽癌临床病理参数的关系/例

2.2 CXCL12蛋白阳性表达与鼻咽癌患者5年生存率的关系

CXCL12蛋白阴性者5年生存率为68.8%，CXCL12蛋白阳性者5年生存率为43.9%，两者比较具有显著性差异(log-rank，χ2=6.07，P=0.01，P<0.05)，见图1。

3 讨论

鼻咽癌是常见多发的恶性肿瘤,大多数患者确诊时为中晚期，转移与浸润是鼻咽癌的治疗与预后主要因素，我们通过研究鼻咽癌患者肿瘤局部的微环境状态，检测鼻咽癌中趋化因子(CXCL12)表达状态，预测肿瘤的治疗和预后因素，探索鼻咽癌复发机制。

趋化因子(CXCL12)是一类最早被发现控制免疫细胞向炎症定向迁移的细胞因子,其功能由相应受体介导,与高迁移率族蛋白1(HMGB1)结合后可产生诱

图1 CXCL12蛋白阳性表达与鼻咽癌患者5年生存率的关系

导靶细胞趋化性迁移等多种生理功能[1]。趋化因子及其受体在多种肿瘤细胞呈高表达,与恶性肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。

CXCLl2基因位于10号染色体长臂，是高度保守的G蛋白偶联的跨膜受体。在胚胎的发育、干细胞的迁移和各种免疫反应中起重要作用，是许多生理和病理过程中指导细胞运动的中心因素，调节细胞的增殖[2-3]。CXCLl2和相应受体CXCR构成的生物学轴在多种肿瘤的生长、转移中发挥重要调节作用，趋化因子能通过刺激肿瘤细胞生长，趋化肿瘤细胞以及促进血管生长和消化细胞外基质的间接作用促进肿瘤的的生长和转移[4]。肿瘤细胞的迁移是由其所表达的趋化因子受体和靶器官表达的趋化因子所决定，与肿瘤的新生血管的形成有关，而CXCLl2和CXCR结合物在恶性肿瘤的生长与转移过程中，主要是促进肿瘤血管的形成，进而调控肿瘤细胞生长增殖，Salvucci等[5]研究表明闭血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞通过抗CXCLl2-CXCR4抗体阻断CXCLl2-CXCR4的功能或iRNA技术使得CXCLl2-CXCR4基因沉默，可抑制血管生长因子依赖的血管生成，从而抑制肿瘤的生长。

本研究中CXCLl2阳性表达患者转移率高于阴性表达患者，且与临床分期密切相关提示CXCLl2的表达增高与鼻咽癌生长增殖和转移有关。该研究结果与Lshigami等[6]和Yasumoto等[7]关于胃癌的研究结果一致，CXCL12作为1种与肿瘤侵袭、转移密切相关的因子，可为鼻咽癌的肿瘤预后标记物之一。CXCLl2阳性表达患者5年生存率明显低于阴性表达者，因此根据患者肿瘤组织CXCLl2表达情况，给与个体化的综合放化疗辅助治疗，提高患者的生存率。

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