胃腺癌中ROS1基因重排及其临床意义

魏亚宁 王娅南 贾友超 谭莉莉 臧爱民

胃癌是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤,胃腺癌是胃癌中最常见的组织学类型，因此在研究胃癌发病机制中备受关注。近年来认为RTK染色体重排存在于常见的多种恶性肿瘤中，ROS1属于Ⅱ类受体酪氨酸激酶(RTK)的胰岛素受体家族,在对进展期胃癌治疗靶点的探索研究中发现原癌基因1(ROS1基因)，针对ROS1基因重排的进一步研究终将为胃腺癌个体化治疗铺就蓝图，基于此,我们对胃腺癌中ROS1基因重排的发生频度进行研究，分析ROS1基因重排及其临床意义，探讨ROS1与胃腺癌的关系，进一步阐释ROS1基因重排在胃腺癌人群中发生的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集自2010年7月到2013年6月期间我院收治的、经手术病理检查证实的60例胃腺癌患者，术前均未经放疗和化疗，其中男性患者32例，女性患者28例，平均年龄(54.5±7.8)岁。高分化腺癌14例,中分化腺癌33例,低分化腺癌13例。淋巴结无转移42例,淋巴结转移18例,癌旁组织取自距肿瘤基底部至少5 cm外的黏膜组织。

1.2 试剂及细胞株

ROS1分离探针、兔抗人ROS1、兔抗人TNF-α、兔抗人IL-6多克隆抗体购自美国LLK公司，DMEM 培养基和 0.25% 胰蛋白酶购自美国Abcam公司;胎牛血清购自美国Gibcol公司;MTS 购自美国Promega公司，组织芯片手动制作仪购自美国Beecher Instruments 公司，荧光显微镜购自德国 Carl Zeiss 公司。

1.3 方法

1.3.1 组织芯片( TMA ) 的构建 经两名病理医生阅片并选取有代表性的肿瘤区域，运用组织芯片手动制作仪(美国Beecher Instruments 公司)制作TMA。每例取两点，共制备3个TMA。

1.3.2 荧光原位杂交 将石蜡切片脱蜡，水化，漂洗，晾干待用。取10 μL探针混合液73 ℃变性 5 min，覆盖待用组织上并加盖玻片，橡胶胶水封片。采用荧光显微镜观察肿瘤细胞的FISH信号。ROS1分离探针混合液所使用的细菌人工染色体克隆包括FIG-ROS1、CD74-ROS1、SCL34A2-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR2-ROS1。

1.3.3 免疫组化染色 对于 TMA 上组织孔缺失或无肿瘤组织的病例，选取代表性肿瘤组织切片，行ROS1、TNF-α、IL-6免疫组化染色。将石蜡切片脱蜡修复后，滴加第一抗体(ROS1、TNF-α、IL-6抗体，均为1∶100稀释)，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育，显色并以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.4 结果判定

免疫组化结果判定:其着色深度等级分为四级(无着色为0分、着色浅为1分、着色中等为2分、着色深为3分)；着色范围等级分为五级(0～1%为0分、2%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75% 为3分、>75%为4分)，两者评分的乘积在0～4分之间判定为阴性和弱阳性，4分以上判定为强阳性。 荧光原位杂交结果判定:ROS1未发生重排使用ROS1分离探针可检测出两对共定位绿色和红色信号。ROS1发生重排时出现两个共定位信号之一的分离或缺失。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 ROS1表达与胃腺癌临床病理学指标的关系

在胃腺癌组织中ROS1阳性表达率为53.3%(32/60)，其中发现SCL34A2-ROS1基因重排发生频率为1.7%(1/60),未检测到FIG-ROS1、CD74-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR 2-ROS1基因重排阳性患者。ROS1蛋白过表达与胃癌淋巴结转移呈显著正相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、发生部位、肿瘤直径、Laurén分类、病理分级、HP 感染、浸润深度和TNM 分期等无关，见表1。

表1 ROS1蛋白表达与胃腺癌临床病理学指标的关系/例

2.2 ROS1表达与胃腺癌预后的关系

60例患者随访8～44个月，中位时间为24个月。Kaplan-Meier分析结果显示，ROS1过表达患者总体生存率低于ROS1阴性及弱表达患者(P<0.05)，见图1。

2.3 胃腺癌中TNF-α、IL-6蛋白表达与ROS1基因重排的关系

在胃腺癌ROS1蛋白阳性者中TNF-α、IL-6蛋白阳性表达率明显高于ROS1蛋白表达阴性及弱阳性者，ROS1基因重排与TNF-α、IL-6蛋白过表达呈正相关，具有统计学意义，P<0.05，见表2。

图1 ROS1蛋白表达与胃腺癌患者总体生存率的关系

表2 TNF-A和IL-6 蛋白表达与ROS1表达的相关性(例，%)

3 讨论

迄今为止，在多种癌症中已发现多种不同的ROS1融合基因，尽管ROS1受体酪氨酸激酶的正常功能尚未确，但ROS1异位表达以及ROS1激酶的变异活化见于诸多肿瘤[1]。近年针对ROS1受体的研究认为ROS1受体酪氨酸激酶参与激活多条下游信号转导通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途径。传统的研究已发现RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3与肿瘤细胞增殖有密切关系[2-7]。故本研究采用 FISH 的方法，首次系统检测ROS1基因重排在我国胃腺癌人群中发生的频度和临床病理特征。

ROS1基因在进化上相对保守，属于II类RTK的胰岛素受体家族，位于第6号染色体q21区，全长cDNA包含44个外显子，编码2347个氨基酸，分子量为259 kDa[8-10]。自1982年发现至今认为其具有独特致癌作用的基因，研究显示ROS1基因重排可能与癌症的发病有关系[11]，随着越来多的ROS1基因重排组合被发现，为进一步了解癌症患者的病情变化及个体化疗效果差异有着重要的意义，复发与转移是胃腺癌患者的主要死亡原因，针对不同的基因重排使用不同有针对性的治疗方案成为个体化治疗的最终梦想。

本研究中胃腺癌患者中ROS1基因融合发生率为1.7%(1/60)。但依据我国关于肺癌中的ROS1基因融合发生率约为1%～2%，与本文发生率一致，远远低于EGFR突变和 ALK重排变异，此数据也从另一方面证实ROS1基因相对保守[12]。因此，本研究发现ROS1的过表达和肿瘤的淋巴结转移呈正相关，提示ROS1基因可能在胃腺癌的转移中发挥重要的作用。但ROS1基因通过何种途径调控信号转导尚不清楚，本研究通过在ROS1过表达的胃腺癌患者与ROS1阴性表达的胃腺癌患者的生存预后的比较，发现ROS1过表达者生存率低，认为ROS1的过表达在我国胃腺癌人群中是一个预后不良因子。

TNF-α、IL-6是由单核/巨噬细胞产生的细胞因子，在多种肿瘤研究中认为TNF-α、IL-6蛋白过表达与肿瘤的恶性程度相关，高表达预示着远处转移及预后差[13]。本研究发现TNF-α、IL-6蛋白在在胃腺癌患者ROS1蛋白阳性者中阳性表达率明显高于患者ROS1蛋白阴性及弱阳性者，ROS1基因重排与TNF-α、IL-6蛋白过表达呈正相关。ROS1基因重排与TNF-α、IL-6蛋白高表达亦可能发挥协同作用，促使胃腺癌疾病的发生、发展。科学家发现ROS1重排阳性者对厄洛替尼治疗无效，改用克唑替尼治疗，可在短时期内改善患者的不适症状，患者继续用药6个月无复发迹象。这表明，克唑替尼对ROS1重排阳性NSCLC患者有明显治疗效果，ROS1重排阳性肿瘤患者是否对克唑替尼治疗更加敏感仍需要大样本、更多临床研究单位参与和证实[14-15]。像本研究一样，本研究标本量少，仅仅发现1例SCL34A2-ROS1基因重排，故仍未发现两者之间的相关性及其机制。

综上所述，ROS1基因主要影响胃腺癌的发病风险性，而与胃腺癌的淋巴结转移有一定的相关性，并发现ROS1基因重排与TNF-A、IL-6表达呈一定的关联性。因此，ROS1基因重排的检测可能对患者的治疗及预后的判定提供参考。但由于时间紧迫，本实验所收集的病例组例数较少，未能更全面的分析其综合重组率及其与其他临床资料的线性关系比较。

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