甘草苷对黄褐斑小鼠模型SOD、MDA、NO含量及黑素瘤A375细胞增殖的影响

应 隆 徐丽歌 应 倩

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

黄褐斑发病率较高，好发于青年女性，其发病机制非常复杂，与精神压力、紫外线照射、妇科疾病、内分泌紊乱以及女性大量使用避孕药、化妆品有关。近年来，对该病的研究较多，但对其病因及病变机理未得到任何实质性进展，临床治疗多以中医验方内服外敷为主。甘草苷(LQ)为中药甘草中的主要成分，有保肝、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等生物活性。本实验在体内采用小鼠体外紫外线局部照射，体内雌激素注射的方法制造黄褐斑模型，用LQ进行干预治疗，观察LQ对黄褐斑模型小鼠抗氧化，抗黄褐斑的作用，在体外以人黑素瘤A375细胞株为模型，观察LQ对人黑素瘤细胞株A375增殖的影响，在动物整体及细胞水平研究LQ对黄褐斑的治疗作用及机制，为中药治疗黄褐斑提供实验依据。

1 材料

1.1动物及细胞株 昆明种雌性SPF级小鼠60只，体重(30±2)g，吉林大学动物中心提供。人黑素瘤A375细胞株，吉林大学基础医学院提供。

1.2药品试剂 LQ，中国药品生物制品检定所，批号：201002；黄体酮注射液，10 mg/ml，批号100407,山西晋新双鹤药业有限责任公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒，南京建成生物工程公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，Gibco公司。

1.3方法

1.3.1实验分组、模型制备 小鼠按体重随机分为空白对照组、模型组、LQ低剂量组(15 mg·kg-1·d-1)、LQ中剂量组(30 mg·kg-1·d-1)、LQ高剂量组(60 mg·kg-1·d-1)和维生素C组。空白对照组肌肉注射生理盐水(2 ml·kg-1·d-1)，其余各组肌肉注射黄体酮注射液(20 mg·kg-1·d-1)。同时，各组小鼠背部脱毛，面积约2×2 cm2，除正常组外，其余各组照射紫外线1次/d，紫外线波长315 nm，30 min/次，小鼠距光源垂直距离20 cm，连续30 d。

1.3.2给药方法 造模同时，空白对照组、模型组给予生理盐水灌胃(0.5 ml/d)，LQ各剂量组给予相应LQ双蒸水溶液灌胃(0.5 ml/d)，维生素C组给予维生素C水溶液(0.5 ml/d)，1次/d，连续30 d。

1.3.3取材及指标检测 实验第31天，各组小鼠麻醉后，经腹主动脉取血，3 500 r/min离心10 min，取上清。取经紫外线照射的脱毛部位皮肤，生理盐水中漂洗，取0.5 g全层皮肤，用眼科剪剪碎，加入4 ml生理盐水，冰浴匀浆，3 500 r/min离心15 min，取上清。按试剂盒说明书操作，测定血清及皮肤组织中SOD、MDA等的含量。

1.3.4作用于A375人黑素瘤细胞增殖的影响 采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)，取A375人黑素瘤对数生长期细胞，浓度5×104/ml，接种于96孔板中，100 μl/孔。放置CO2培养箱24 h，弃去上清，加入浓度为0.1，1，10 μmol/L LQ的培养基，100 μl/孔，培养48 h。加入浓度为5 mg/ml MTT 20 μl，培养4 h，弃上清。每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μl。振荡10 min，酶标仪570 nm波长测定吸光度(A)值。细胞增殖抑制率(％)=(1-A给药组/A对照组)×100％。

2 结 果

2.1LQ对黄褐斑模型小鼠血清中SOD、MDA、NO含量的影响 与对照组相比，模型组MDA含量显著升高，SOD、NO含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。 与模型组相比，LQ中、高剂量组血清中MDA含量显著降低(P<0.05)。LQ低、中、高剂量组血清中SOD含量显著升高(P<0.05，P<0.01)，呈剂量依赖性。LQ中、高剂量组血清中NO含量显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 LQ对黄褐斑模型小鼠血清中SOD、MDA、NO含量的影响

2.2LQ对黄褐斑模型小鼠皮肤组织中SOD、MDA、NO含量的影响 与对照组相比，模型组MDA含量显著升高，SOD、NO含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。与模型组相比，LQ低、中、高剂量组组皮肤中MDA含量显著降低(P<0.05)。LQ 高剂量组皮肤中SOD含量显著升高(P<0.05)，有显著差异。LQ中剂量组皮肤中NO含量显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 LQ对黄褐斑模型小鼠皮肤组织中SOD、MDA、NO含量的影响

2.3LQ对A人黑素瘤375细胞增殖的影响 与对照组(OD值0.619±0.137)相比，LQ 1，10 μmol/L组对A375人黑素瘤细胞增殖有明显的抑制作用(OD值分别为0.492±0.109,0.468±0.117)(P<0.05)，其抑制率分别为20.52％，24.39％。而LQ 0.1 μmol/L抑制率为13.25％，OD值0.537±0.091。

3 讨 论

黄褐斑好发于中、青年女性，中医认为“由忧思抑郁，血弱不华，火燥结滞而生于面上〔1〕。”黄褐斑的发生是全身系统的血气、脏腑、经络失调的局部体现，肝肾亏虚，气滞血瘀，最终导致面部皮肤失去养分，丧失润泽诱发色斑。现在医学认为，黄褐斑是由人体黑色素生成异常，其发生机制有多种原因形成，如紫外线等理化因素刺激、氧化应激失衡、内分泌失调〔2〕、血流变学异常、肝脏等慢性疾病〔3〕、失眠等神经因素〔4〕等。而氧化与抗氧化的失衡，是黄褐斑公认的主要诱因。当机体内脂质过氧化增强，氧自由基增多时，体内的SOD、过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px等就会增加，清除多余的氧自由基，使机体内氧化与抗氧化处于动态的平衡。黄褐斑的患者氧化应激系统障碍，使体内的抗氧化物质不随脂质过氧化物的增多而增强，过多的脂质过氧化物加速酪氨酸氧化，形成黑色素增多。LQ能明显降低黄褐斑模型小鼠血清中MDA含量，升高SOD、NO活性，同时，能显著提高黄褐斑模型小鼠皮肤中SOD活性，降低MDA含量，延缓模型小鼠的皮肤黑色素的沉积。A375为人皮肤黑素瘤细胞株，其黑素合成功能与人体正常皮肤黑素细胞基本一致。本实验结果提示LQ可以抑制黑素细胞的增殖，从而抑制黑素的合成，其具体作用机制有待进一步研究。

4 参考文献

1吴 谦.医宗金鉴〔M〕.北京:人民卫生出版社，1963:130.

2Moin A,Jabery Z,Fallah N.Prevalence and awareness of melasma during pregnancy〔J〕.Int J Dermatol,2006；45(3):285-8.

3陈志伟，丁爱国，聂小玲.女性黄褐斑患者的甲状腺功能测定〔J〕.中华皮肤科杂志，2005；38(11):704-5.

4林新瑜，罗旭松，向雪岑，等.150例黄褐斑患者发病因素的统计分析〔J〕.华西医学，2003；18(3):329-30.