按摩通过改善VEGF活性及血供促进兔骨骼肌损伤修复

谢 辉 唐成林 陈晓琳 唐念珍 韦贵勇

(重庆医科大学中医药学院中医药研究室，重庆 400016)

肌肉钝挫伤是肌肉损伤发生率最高的一种，常见于对抗性体育项目或意外事故〔1〕。对日常生活和继续参加体育运动均造成不利影响〔2〕。对于老年人来讲，跌扑损伤更易发生，影响正常体育活动，甚至影响正常生活。损伤造成机体部分细胞和组织丧失后，机体对所形成的缺损进行修补恢复的过程称为修复，修复后可完全或部分恢复原组织的结构和功能。本文观察骨骼肌挫伤愈合过程中形态和血管内皮生长因子(VEGF)的变化，探讨按摩在骨骼肌挫伤恢复过程中的作用及其应用价值。

1 材料与方法

1.1实验动物分组和制模 实验兔为纯种健康成年雄性新西兰大白兔42只，体重(2.0±0.5)kg，由重庆医科大学实验动物中心提供(医学动物合格证SCXK渝20120001)，分笼饲养，适应性饲养7 d后被随机分为正常组(A 组，n=3)、按摩前损伤组(B组，即损伤后第3天，n=3)、损伤后第5天按摩组(C组，n=9)和自然恢复组(D组，n=9)、损伤后第10天按摩组(E组，n=9)和自然恢复组(F组，n=9)。

采用重物打击法制作兔股四头肌急性损伤模型〔3〕。用自制底面平滑的重力铅锤(锤长10 cm、重0.5 kg、直径2.5 cm；塑料导向管长100 cm，直径3.0 cm)进行重力打击，为保证每只实验兔所受撞击力度和损伤范围一致，由同一人执行每次的铅锤投放和导管固定。造模成功的标准：肉眼可见打击部位出现肿胀和淤血，同肌肉撞伤相似，无皮肤破裂及骨折。

1.2试剂和仪器 主要试剂：8％硫化钠脱毛剂，Ⅰ抗：VEGF 抗体(北京博奥森)；Ⅱ抗：辣根过氧化物标记生物素(北京博奥森)；BCA蛋白定量试剂盒250次(上海贝博)。

主要仪器：酶标仪(Biocell，中国)；Chem Gel-DocXR凝胶成像分析系统(Bio-Rad)；电泳仪(DYY-6C，中国北京六一仪器厂)；AFY-10按摩器(天津京康瑞福科技发展有限公司)；荷兰飞利浦公司产飞利浦iu22 高端彩超诊断仪(L12-5 高频探头，频率10 MHz)。

1.3方法

1.3.1按摩干预 造模后第4天开始按摩治疗〔4〕，对照组不进行。1次/d，15 min/次，按摩转速为2 600 r/min，直接在受损组织及临近部位按摩，直至处死取材。

1.3.2超声检查 经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(25 mg/kg)对实验兔行全身麻醉，经8％硫化钠脱毛，在实验台上用胶布固定。造影剂于使用前注入3 ml双蒸水，迅速振摇至其完全溶解，于耳缘静脉注射，即刻对受损股四头肌用飞利浦iu22高端彩超诊断仪进行局部超声诊断，观察并记录回波图像。

1.3.3取材与预处理 将实验动物分别于损伤后第5、10天，空气栓塞法处死。快速切取造模处股四头肌，即刻对受损股四头肌用预冷PBS清洗，纵切取4块，将其中2块(1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm)肌组织标本，于4％多聚甲醛固定液固定过夜，用于H&E染色(固定组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，苏木精和伊红染色)。另2块(约1.5 cm×1.0 cm×0.3 cm)标本立即置液氮冷冻，于-80℃低温冰箱保存备用，用于Western印迹检测。

1.3.4Western印迹检测兔骨骼肌中VEGF表达 取股四头肌样本加入适量组织细胞裂解液，电动匀浆器搅碎，冰浴30 min裂解，12 000 r/min离心5 min后取上清，测定蛋白浓度。40 μg蛋白经10％ SDS-PAGE 电泳，电转膜仪转移至NC膜，丽春红染色，有条带则继续下一步实验。5％脱脂牛奶封闭，PBST 漂洗3次；加入Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，取出Ⅰ抗，PBST漂洗3次，10 min/次；加入辣根过氧化物标记的Ⅱ抗，摇床轻摇1 h，TBST室温脱色摇床上洗3次，每次10 min；将膜置入发光盘中，加入发光试剂( ECL)进行化学发光反应，Alpha软件处理系统分析获取目标蛋白、内对照蛋白的灰度密度值，目的条带和内参照条带的灰度比值评价各组VEGF的变化。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件，组间比较采用单因素方差分析，同组两时间点比较采用独立样本t检验。

2 结 果

2.1按摩对形态学的影响 光镜下观察，正常组肌纤维排列整齐，且大小一致(图1A)。损伤后第3天组，肌纤维大量断裂、崩解，部分萎缩，肌纤维明显萎缩、扭曲、坏死，间隙明显增大，炎症反应明显(图1B)。损伤后第5天两组肌纤维萎缩、坏死均明显减轻，自然恢复组与按摩组相比炎症反应仍较明显，且肌纤维间隙较大、排列紊乱，可见明显结缔组织填充，而按摩组新生的肌纤维明显较对照组多，且排列紧密(图1C，1D)。损伤后第10天，按摩组肌纤维排列相比对照组更紧密整齐，肌纤维间见少量结缔组织填充，同正常组逐渐较接近，而损伤后第10天自然恢复组肌纤维排列仍较紊乱，结缔组织同肌纤维交织，颜色呈苍白色，肌纤维之间仍有结缔组织填充(图1E，1F)。

A：正常组；B：伤后第3天组；C：伤后第5天按摩组；D：伤后第5天自然恢复组；E：伤后第10天按摩组；F：伤后第10天自然恢复组；下图同

2.2按摩对损伤局部血供的影响 正常组(2A)肌肉血供良好；制模后第3天组(2B)可见大范围的坏死组织，且内部无血液供应，无血管生成；制模后第5天按摩组(2C)显示坏死范围较自然恢复组(2D)减小，有部分微泡可见于坏死组织内部，表明坏死组织内部血管部分生成，其周围微泡密度和亮度均较自然恢复组(2D)高。制模后第10天自然恢复组(2F)可见血液供应仍不佳，坏死范围也明显减少，但与按摩组(2E)仍有较大差别，此时按摩组(2E)只有微小的坏死组织，血液供应情况很好，与正常组织逐渐接近。

图2 超声微泡显示结果

2.3按摩对VEGF表达量的影响 VEGF在正常组织中几乎不表达，损伤后修复过程中各组与正常组(0.06)比较表达均显著增多(P<0.01)。损伤后第3天组VEGF相对表达量(0.78)明显高于正常组(P<0.01)，经过按摩干预后，损伤后第5天，按摩组VEGF表达水平(0.80)较自然恢复组(0.63)偏高(P<0.01)；同样，损伤后第10天，VEGF在自然恢复组(0.20)表达水平明显低于按摩组(0.27)(P<0.01)。见图3。

图3 各组VEGF表达

3 讨 论

血液循环系统在组织损伤修复过程中的作用是不可替代的。血管形成主要包括血管发生，血管生成和动脉生成3个过程〔5〕。骨骼肌损伤后，会造成局部缺血缺氧，在低氧和炎症的刺激下巨噬细胞、T细胞、星形胶质细胞、周细胞、平滑肌细胞均能分泌VEGF〔6，7〕。VEGF及其受体是血管生成中最好的特色信号路径〔8〕。我们前期的研究显示，按摩可以改善血液“浓、粘、凝、聚”的状态，加快血液流动，改善血液黏稠度，利于损伤区域充足血供，并减轻局部坏死，为组织细胞提供更多的血氧，有利于局部内环境的改善，减少了组织细胞的变性、坏死〔9〕。

VEGF是一种具有肝素结合活性的生长因子，作用于血管内皮细胞，在许多正常组织组织中广泛存在，如脑、皮肤、肺、肾、心肌、骨骼肌和小肠等许多组织都有不同程度的表达，是具有高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素。在我们的实验中也可观察到，正常组织中VEGF表达很少，损伤后其表达量迅速增加。VEGF的作用很多：①促进内皮细胞的增殖，是目前已知的作用最强的促血管生成因子。有研究表示，VEGF的表达与组织中微血管的密度及新生血管的数量密切相关〔10〕，可明显促进拉伤处内皮细胞的增殖，在体内诱导血管形成，加快血管内皮的愈合〔11〕。②对血流动力学的影响。也有研究显示，静脉滴注VEGF可增加心率及心输出量，降低血管外周阻力，对心肌收缩力无明显的影响〔12〕。③抗血栓，还可促进血管内细胞的愈合，使内膜内皮化，间接地抗血栓形成〔13〕。

本文结果显示，按摩组同自然恢复组相比，新生的肌纤维明显较对照组多且排列紧密。在超声检查中，经按摩干预后，损伤部位的血液供应有了明显改善，有新生血管生成，微泡密度和亮度均增高，坏死范围也明显减少。炎症趋化因子可以促进VEGF的分泌〔15〕，进而作用于血管内皮细胞、刺激毛细血管网的增殖，增加氧的输送〔16〕。VEGF也可通过p38MAPK 通路诱导表达，引起人脐静脉内皮细胞的迁移〔17〕。对于这一机制仍需进一步探索和研究。

推拿手法能达筋骨节窍之血气凝滞，甚至还能调节情志之苦欲，因而能够通过筋骨节窍实现移精变气。推拿具有适应面广泛、手法操作较简单、安全性高的特点；对神经系统、消化系统及循环系统有治疗、调节、健体的功能；对运动系统有提高人体运动能力、消除运动疲劳的作用；对运动损伤的康复具有促进血液循环，改善供血，加速损伤组织修复、镇痛、缓解痉挛肌群、关节归顺的功能；更对老年人有缩短疗程、减轻痛苦、节省时间、节约开支的价值。

4 参考文献

1Kasemkijwattana C，Menetrey J，Day CS，etal.Biological intervention in muscle healing and regeneration〔J〕.Sports Med Arthrosc Rev，1998;6(2)：95-102.

2Rouwkema J，Rivron NC，van Blitterswijk CA.Vascularization in tissue engineering〔J〕.Trends Biotechnol，2008;26(8)：434-41.

3刘仁建，唐成林，邹 敏,等.按摩抑制兔钝挫伤骨骼肌瘢痕形成的机制研究〔J〕.中华物理医学与康复杂志，2012;34(10)：742-6.

4石茜明，王学礼，按摩对肌肉损伤修复作用的形态学研究〔J〕.中国运动医学杂志，1991;10(4)：201-5.

5Carmehet P.Manipulating angiogenesis in medicine〔J〕.J Intern Med,2004;255(5)：538-61.

6McClung JM，McCord TJ，Keum S，etal.Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice〔J〕.Am J Pathol,2012；180(5)：2156-69.

7Qasi Y，Maddula S，Ambati BK.Mediators of ocular angiogenesis〔J〕.J Genet，2009;88(4)：495-515.

8刘林奇，鲁 峰，高建华.血管内皮生长因子参与血管形成的机制研究进展〔J〕.中华实验外科杂志，2012;29(4)：770-2.

9郜 婕，唐成林，邹 敏,等.穴位按摩对受损骨骼肌血管内皮生长因子表达、微泡超声造影及血液流变的影响〔J〕.中华物理医学与康复杂志，2013;35(2)：91-6.

10Maeda K，Chung YS，Ogawa Y，etal.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma〔J〕.Cancer，1996;77(5)：858-63.

11Asabara T，Bauters C，Plastore C，etal.Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery〔J〕.Circulation,1995;91：2793-801.

12祁 明，郑亚宁.血管内皮生长因子的研究进展〔J〕.青海师范大学学报，2010;26(4)：61-6.

13周 泉.血管内皮生长因子的生物学特性及临床研究进展〔J〕.实用心脑肺血管病杂志，2001;9(1)：51-4.

14彭 芳，陈 明.抗血管生成和肿瘤血管正常化的研究进展〔J〕.中国肺癌杂志，2009;12(7)：799-804.

15Pugh CW，Rateliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system〔J〕.Nat Med,2003;9：677-84.

16Yu J，Bian D，Mahanivong C，etal.p38 mitogen-activated protein kinase regulation of endothelial cell migration depends on urokinase plasminogen activator expression〔J〕.J Biol Chem，2004;279(48)：50446-54.