Bach1克隆构建及其对肝癌细胞药物敏感性的影响

时英英 杨 靖 时学秀 单 杰

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450052)

转录因子BTB-CNC同源异构体(Bach)1属于CNC转录因子家族，在体内广泛存在，它是一种碱性亮氨酸拉链蛋白，其包含一个碱性亮氨酸拉链结构域和一个锌指结构域，二者皆与Bach1的转录调控作用有关〔1〕。关于Bach1的研究主要集中在其对血红素氧化酶1(HO-1)的作用上。HO-1具有抗氧化、抗凋亡等效应，实验证实HO-1是一类保护细胞及抗氧化损伤的酶类，其表达可通过许多转录因子进行调控。Bach1在核内抑制HO-1的表达〔2〕。

1 材料与方法

1.1材料 大肠杆菌菌株E.Coli.DH5α、质粒pBI-EGFP、质粒pTet-Off、人肝癌细胞系SMMC-7721：本室保存；质粒pQE30-Bach1：美国教授馈赠；限制性核酸内切酶NheⅠ，MluⅠ，KpnⅠ，HindⅢ：Fermentas公司；PCR产物纯化试剂盒：上海捷瑞生物工程股份有限公司；RPMI1640培养基：Gibco公司； 无支原体胎牛血清：北京索来宝公司；脂质体2000转染试剂：Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒：华北制药集团有限公司。

1.2重组质粒pBI-EGFP-Bach1的构建

1.2.1目的基因Bach1的获取 采用CaCl2法制备感受态细菌，质粒pQE30-Bach1转化进大肠杆菌DH5α，使用质粒提取试剂盒小量提取质粒,从提取的质粒 DNA中吸出少量,适当稀释,使用紫外分光光度仪测定 OD260,计算质粒浓度，双酶切鉴定质粒pQE30-Bach1，PCR扩增Bach1片段，PCR产物纯化回收，1%琼脂糖凝胶电泳检测,使用凝胶成像系统分析酶切结果。

1.2.2构建重组质粒pBI-EGFP-Bach1双酶切 处理质粒载体pBI-EGFP及目的基因Bach1，1%琼脂糖凝胶电泳后,使用胶回收试剂盒按说明书分别回收pBI-EGFP和Bach1，纯化后片段在 T4 DNA连接酶作用下进行连接，连接反应产物转化感受态细菌，提取并鉴定重组质粒。

1.3重组质粒pBI-EGFP-Bach1在肝癌细胞SMMC-7721中的表达

1.3.1细胞培养 使用10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱培养肝癌细SMMC-7721，隔天换液,保持细胞生长状态良好，每次实验使用细胞均处于对数生长期。

1.3.2转染细胞 细胞计数后以1×105/孔接种在96孔板中，分为三组 ①阴性对照即未转染组；②空质粒转染组pBI-EGFP和Tet-off；③重组质粒组pBI-EGFP-Bach1和Tet-off的细胞。每组设3个平行孔。24 h贴壁后进行转染。脂质体转染参考说明书并按照需要改动。

1.3.3RT-PCR鉴定转染重组质粒后转录因子Bach1、HO-1的RNA表达 RT2-PCR鉴定重组质粒mRNA表达提取细胞总RNA,使用InvitrogenM2MVLcDNA第一链合成试剂盒合成 cDNA第一链,取上述转录产物各 2 μg作为 PCR扩增的模板。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,用RGB颜色分析器4.0分析电泳结果，用扫描所得出Bach1、HO-1基因与β-actin基因的灰度值比值表示该基因的相对表达水平，并对Bach1、HO-1基因在空白组，空质粒转染组和重组质粒转染组中的表达进行分析。

1.4重组质粒pBI-EGFP-Bach1对肝癌细胞SMMC-7721药物敏感性的影响 MTT〔3〕法检测细胞对长春新碱(VCR)的药敏性，设立对照组，未转染组、转染组。其中对照组细胞不做药物或转染处理，未转染组只用长春新碱处理，转染组先转染重组质粒，转染24 h后，加入不同浓度的VCR溶液：0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 μg /ml，MTT法检测三组肝癌细胞对VCR的药敏性。计算存活率〔存活率=(实验孔OD值/对照孔OD值)×100%〕。计算50%细胞生长抑制所需的VCR药物浓度即半数抑制率(IC50)。

1.5统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t及χ2检验。

2 结 果

2.1双酶切鉴定质粒pQE30-Bach1 KpnⅠ/HindⅢ双酶切质粒pQE30-bach1后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到约3 400 bp和约2 200 bp的片段，大小与质粒pQE30及目的基因Bach1一致(见图1)。说明质粒pQE30-Bach1中含有目的基因Bach1基因全序列。

2.2PCR扩增Bach1片段的纯化回收 PCR扩增出含有酶切位点MluI/NheI的目的基因Bach1片段后回收，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到约2 200 bp片段，大小与目的基因Bach1一致。(见图2)。

2.3重组质粒pBI-EGFP-Bach1的鉴定 MluⅠ/NheⅠ双酶切处理连接后得到的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定可见约5 100 bp和约2 200 bp的片段，大小与质粒pBI-EGFP及目的基因Bach1一致(见图3)。用目的基因Bach1的引物PCR鉴定重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定可见约2 200 bp大小的片段(见图3)。重组质粒pBI-EGFP-Bach1构建成功。

1：HindⅢ单酶切质粒pQE30-Bach1结果；2：KpnⅠ/HindⅢ双酶切质粒pQE30-bach1结果

1，2，3皆为用PCR技术扩增目的基因Bach1所得条带

1：MluⅠ/NheⅠ双酶切重组质粒pBI-EGFP-Bach1所得条带；2：使用重组质粒为模板PCR扩增目的基因Bach1所得条带

2.4RT-PCR鉴定重组质粒在肝癌细胞SMMC-7721中的表达 重组质粒组的Bach1特异片段明显比对照组，空质粒转染组亮。β-actin灰度值的比值依次为：1.04±0.32，1.02±0.39，1.77±0.35差别具有统计学意义(P<0.05)，与1，2组相比3组HO-1明显较暗，β-actin灰度值的比值依次为：0.95±0.22，1.02±0.31，0.74±0.21，差别具有统计学意义(P<0.05)，表明HO-1基因在转染了重组质粒的SMMC-7721细胞中的表达明显比未转染组及空质粒转染组细胞低。结果说明转染重组质粒pBI-EGFP-Bach1后，肝癌细胞SMMC-7721中Bach1表达显著增高，同时抑制了HO-1的表达，使其表达水平降低。见图4。

1：空白对照组；2：空转载体组；3重组质粒组

2.5不同组别药物浓度对SMMC-7721细胞的抑制率 转染组重组质粒pBI-EGFP-Bach1的细胞，在加入VCR后凋亡率比同等剂量未加入重组质粒的细胞明显升高。转染组和未转染组之间差异明显(P<0.05)。未转染组的IC50为0.21 μg/ml，转染组的IC50为0.15 μg/ml。二者相比，转染组的半数抑制浓度低于未转染组28.6%。见表1。

表1 不同组别药物浓度对SMMC-7721细胞的抑制率(%)

3 讨 论

本研究通过基因克隆技术构建了真核表达质粒pBI-EGFP-Bach1。再将重组质粒和其调控质粒Tet-off一同转染进肝癌细胞SMMC-7721中，通过RT-PCR技术在RNA水平上可明显看到重组质粒pBI-EGFP-Bach1能显著抑制细胞中HO-1的表达，基于使用HO-1抑制剂在肿瘤内抑制HO-1活性〔3〕，以达到增强肿瘤细胞的对药物的敏感性，使其在低浓度药物作用下即能凋亡这一思路，本实验将重组质粒pBI-EGFP-Bach1及其调控质粒Tet-off，通过脂质体转染共转染进肝癌细胞SMMC-7721中，使用长春新碱进行肿瘤细胞的体外药敏试验。有研究表明长春新碱对培养的人肝癌细胞株SMMC-7721有较显著的抗癌作用〔4〕。本实验结果表明相同剂量药物作用下，转染了重组质粒pBI-EGFP-Bach1的细胞，在加入VCR后凋亡率比同等剂量未加入重组质粒的细胞明显升高。本实验验证了可通过抑制HO-1的表达来增加肝癌细胞对药物的敏感性，减轻对正常细胞的伤害。

4 参考文献

1郁卫东，梁 蓉，杨丽君，等.人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究〔J〕.中国生物工程杂志，2005；25(7)：66-70.

2Tomomi K,Kazuhiro T,Kazuhiro O,etal.Bach1 functions as a hypoxia-inducible repressor for the Heme Oxygenase-1 gene in human cells〔J〕. J Biol Chem，2003；278(11):9125-33.

3尤迎春，丛文铭，王 一，等.MTT比色分析法快速测定肝癌细胞株对化疗药物敏感性的方法研究〔J〕.癌症，1996；15(3)：219-21.

4马瑾瑜，余竹元，竺叶青，等.长春新碱对培养中的人肝癌细胞的作用〔J〕.上海医科大学学报，1987；14(3)：2.