pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗对肝癌细胞株SMMC-7721、Hepal-6增殖的影响

齐亚灵 孟德欣 杨广民 周晓红 李艳君 杨 宇 谭 岩

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154002)

肿瘤的形成是由于各种致癌因素引起DNA损伤，从而激活原癌基因和(或)灭活抑癌基因；或者凋亡调控基因和(或)DNA修复基因发生改变，进而引起基因表达异常。基因疫苗是将编码抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，将该质粒免疫动物，致使编码抗原的基因片段在宿主体内表达，刺激机体产生免疫应答，诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤。本文观察pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗免疫后小鼠脾细胞诱导的肿瘤特异性 CTL 对肝癌细胞株SMMC-7721、Hepal-6的杀伤作用，探究pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗抗肿瘤作用。

1 材料和方法

1.1细胞株、质粒、实验动物 质粒 pcDNA3、pcIL-18-pcMAGE-1、肝癌细胞株SMMC-7721和Hepal-6为吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心提供。清洁级雌性C57BL/6J小鼠(中国医学科学院实验动物研究所)，体重(20±2)g，自由食水，无菌动物室饲养。

1.2主要试剂和仪器 胎牛血清、IMDM 细胞培养液、淋巴细胞分离液、MTT、DMSO、3%氢氧化铝(武汉博士德公司)。FITC与PE标记的羊抗鼠CD4+、CD8+单抗、FITC标记的羊抗鼠IgG单抗(美国Immunotech公司)。流式细胞仪(FCM)(美国BD公司)、HF240二氧化碳培养箱(上海斯高勒生物科技有限公司)。

1.3实验分组及免疫方法 将30只C57BL/6J小鼠随机分为3组各10只。疫苗免疫组肌注100 μg pcIL-18-pcMAGE-1(0.4 ml 3%氢氧化铝胶)；空白对照组肌注等量生理盐水；阴性对照组肌注等量空质粒pcDNA3。注射部位：小鼠大腿内侧肌群。每隔10 d注射1次，共3次。末次注射7 d后，断头处死小鼠，将取出的脾脏浸入含 10%胎牛血清的IMDM细胞培养液中研磨，用200目滤网过滤，收集脾细胞悬液于玻璃试管中备用。

1.4小鼠T细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞活性检测 每组分别取1×106个小鼠脾细胞，0.1 mol/L PBS洗2次，分别加入单抗10 μl，室温避光，20 min。PBS洗2次，加0.5 ml PBS混匀，10 min后，FCM检测。

1.5小鼠脾细胞CTL活性测定 将SMMC-7721细胞及Hepal-6细胞分别加入到96孔板中，每孔1×104个细胞，同时取阴性对照组及疫苗免疫组的1×106个效应脾细胞分别加入到上述96孔板中，每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育过夜；弃掉培养基，每孔加50 μl 0.5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，弃上清，每孔加100 μl DMSO，酶标仪测570 nm处的吸光值(OD值)。杀伤率(%) = 〔1- (效应细胞+靶细胞)OD值-效应细胞OD值/靶细胞OD值〕×100%。

1.6统计学分析 使用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1T细胞亚群及NK细胞活性检测结果 与两个对照组比较，疫苗免疫组脾细胞中CD4、CD8 T细胞比例及CD4/CD8比值、NK细胞活性显著增高(P<0.01，P<0.05)。阴性对照组与空白对照组差异不显著(P>0.05)。见表1。

2.2免疫小鼠脾细胞对肝癌SMMC-7721细胞及Hepal-6细胞杀伤率 共表达pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗对SMMC-7721细胞及Hepal-6细胞均具有显著抑制性，与对照组比较，差异显著，且对SMMC-7721细胞杀伤率明显高于Hepal-6细胞(P<0.05)，见表2。

表1 各组CD4、 CD8、CD4/CD8及NK细胞值比较(n=10，±s,%)

表2 各组脾细胞对SMMC-7721和 Hepal-6细胞杀伤率(n=3，±s，%)

3 讨 论

基因疫苗是近10年发展起来的新型疫苗，又叫核酸疫苗或DNA疫苗，目前基因疫苗的研究已涉及病毒、支原体、衣原体、寄生虫、螺旋体、细菌以及癌症等诸多领域，一些基因疫苗的研究已处于Ⅰ、Ⅱ期临床研究阶段。基因疫苗与常规的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及重组疫苗相比，具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点。众多学者的实验结果表明，MAGE-1基因、蛋白在多种恶性肿瘤组织中高表达，而在正常组织中不表达〔1～4〕，并且MAGE-1是用T细胞毒方法鉴定的第一个人类肿瘤抗原〔5〕，MAGE被认为是免疫原性最强的肿瘤抗原之一〔6〕，目前，MAGE-1的肿瘤疫苗已进入临床试验，在一些肿瘤的治疗中取得较好的疗效〔6〕。

白细胞介素(IL)-18能够增强NK 细胞的活性，促进 Th1、NK 细胞增殖。IL-18 可产生有效的免疫调节作用，是一种良好的免疫佐剂〔7，8〕，CD4 T为辅助性T细胞，CD8 T为杀伤性T细胞。由此可以推断，pcIL-18-pcMAGE-1共表达基因疫苗通过提高CD4 T比值，对C57BL/6J小鼠MAGE-1抗体生成、巨噬细胞活化、NK细胞活化及CTL的活化有辅助、放大效应，并通过它们发挥免疫作用；通过提高CD8 T比值，增加C57BL/6J小鼠NK细胞活性，促进效应细胞的杀伤功能。并且诱导肿瘤特异性 CTL直接杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。因此，制备以 MAGE-1 抗原为靶点、以IL-18为佐剂pcIL-18-pcMAGE-1基因疫苗通过提高机体免疫功能，促进NK细胞活性，诱导肿瘤特异性 CTL，产生广谱抗肿瘤免疫效应，避免了单一肿瘤疫苗只针对一种肿瘤的局限，具有良好的临床应用前景。

4 参考文献

1Xu LF，Zhu J，Jiao YJ，etal. Expression and characterization of MAGE-1 gene from human hepatocellular carcinoma cells〔J〕.ACTA universitatis medicinalis Nanjing，2006；26(7)：534-37.

2刘 宁，梁 寒，李 强,等.MAGE-1、MAGE-3及AFP基因在肝癌组织中的表达〔J〕. 中国肿瘤临床，2007；34(9)：493-6.

3Yuasa T，Okamoto K，Kawakami T，etal. Expression patterns of cancer testis antigens in testicular germ cell tumors and adjacent testicular tissue〔J〕. J Urol，2001；165(5)：1790-4.

4杨 安. MAGE-1 和 SCP-1 在胃癌中的表达及相关性研究〔J〕.现代肿瘤医学，2014；2(3)：585-7.

5Vander BP，Traversari C，Chomez P，etal.Agene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on human melanoma 〔J〕. Science,1991；254(5038): 1643-7.

6Zhao Y，Zheng Z，Khong HT，etal．Transduction of an HLA-DP4-restricted NY-ESO-1-specific TCR into primary human CD4+lymphocytes〔J〕.J Immunother，2006;29(4)：398.

7Hart G，Flaishon L，Shachar I. IL-12 and IL-18 down-regulate B cell migration in an Ly49D-dependent manner〔J〕. Eur J Immu，2007；37(7)：1996-207.

8时 阳，杨广民，李首庆,等.MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗的构建与体外表达〔J〕. 中国老年学杂志，2007；27(19)：1865-8.