原发性非小细胞肺癌患者外周血中Th17的检测及其临床意义

司立博 田 辉 亓 磊 岳韦名 李 林 李树海 高 存 田 煜

(山东大学齐鲁医院胸外科，山东 济南 250012)

Th17细胞(Th17)是不同于Th1、Th2细胞的CD4+辅助性T细胞(Th)的新亚群，其在免疫系统中发挥重要作用〔1〕，并通过分泌白细胞介素(IL)-17A/F、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症相关细胞因子参与多个重要生理病理进程。近年来Th17细胞在肿瘤发生中的作用引起了广泛的关注。孤独核受体γt (RORγt)是Th17细胞分化调控的关键转录因子，在Th17细胞的分化发育及调控IL-17分泌的过程中起着重要作用〔2～7〕。Th17细胞的主要效应因子是IL-17，已有研究表明在多种肿瘤中如胃癌、食管癌、结肠癌、卵巢癌中均可检测到Th17细胞、转录因子RORγt及IL-17的高表达〔8～10〕。在非小细胞肺癌(NSCLC)动物肿瘤模型中发现IL-17可促进肿瘤新生血管的发生，利于肿瘤生长、浸润和转移〔11〕。在本课题中，通过检测NSCLC患者与健康对照组外周血Th17细胞及其转录因子RORγt和细胞因子IL-17的水平，从细胞和分子水平探讨Th17细胞在NSCLC发生发展中的意义。

1 材料与方法

1.1临床资料及标本 选取2010年10月至2011年10月在山东大学齐鲁医院胸外科行肺癌切除加系统性淋巴结清扫术的NSCLC患者的术前外周血。所有病例均经病理学确诊，NSCLC诊断标准参照世界卫生组织(WHO)2004年的肺肿瘤组织学分类标准，其中鳞癌23例，腺癌28例；术后病理分期参照国际肺癌研究协会(IASLC)2009年的TNM分期标准，其中Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ期20例。共有51例患者纳入本研究，其中男36例、女15例，年龄31～81(60±9.34)岁，所有患者均无免疫性疾病及其他肿瘤病史，术前均未行抗肿瘤治疗和免疫治疗。健康对照组26例，全部为健康志愿者，其中男14例、女12例，年龄25～65(51±7.82)岁。术前取外周血5 ml，肝素钠抗凝。所有受试者均签署知情同意书，并报伦理委员会批准。

1.2主要试剂 FITC标记的小鼠抗人CD4抗体和PE标记的小鼠抗人IL-17抗体均购自eBioscience公司。Trizol试剂：购自Invitrogen公司。IL-17的ELISA试剂盒：购自上海远达晶美生物技术有限公司。逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.3外周血单个核细胞(PBMCs)的分离与培养及血浆的分离 取实验组和健康对照组肝素抗凝外周静脉血5 ml于无菌试管中,用等量PBS稀释后，缓慢加入含淋巴细胞分离液的50 ml离心管中(淋巴细胞分离液：血液为1∶2)，2 500 r/min离心20 min，吸取中间层单个核细胞，用3 ml PBS洗涤2遍后即为PBMCs。

1.4流式细胞术检测外周血中Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例 于PBMCs细胞悬液中加入10 μl FITC标记的小鼠抗人CD4抗体，置4℃避光孵育30 min。用PBS洗涤后，再加入100 μl固定剂振荡混匀，于室温孵育15 min。加入100 μl破膜剂和10 μl PE标记的抗IL-17抗体，室温孵育30 min；以PBS重悬细胞后，用流式细胞仪检测。检测结果采用CellQuest软件进行分析。Th17细胞的水平以CD4+IL-17+细胞在CD4+T细胞中的百分率表示。

1.5RT-PCR检测PBMC中IL-17及RORγt mRNA的表达 采用Trizol试剂，酚-氯仿法提PBMCs的总RNA，反转录过程按照试剂盒说明书操作获得cDNA。PCR引物(β-actin为内参基因)由Primer5.0软件设计并由济南博尚公司合成(序列见表1)。实时定量PCR以SYBR Green为荧光染料，使用ABI 7500 PCR系统。目的基因的表达量通过2△Ct与内参基因对比(△Ct=Ct目的基因/Ct内参基因)。PCR程序设置如下 ：95℃ 10 min解链，95℃ 15 s 62 ℃ 1 min，共计40个循环。

1.6ELISA法检测外周血浆中IL-17的含量 采用双抗体夹心ELISA法测定。具体操作按照IL-17的ELISA检测试剂盒提供的说明书进行,每个样本和标准品均设3个复孔。

表1 IL-17、RORγt及β-actin引物序列及产物长度

2 结 果

2.1NSCLC患者外周血中Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例升高 NSCLC患者外周血Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例为(2.78±0.59)%，显著高于健康对照组外周血Th17细胞所占比例(0.59±0.15)%(P<0.01)。

2.2RT-PCR检测PBMC中IL-17及RORγt mRNA的表达水平 与管家基因β-actin相比，IL-17的相对表达量在NSCLC患者为1.767±0.32；转录因子RORγt的相对表达量在NSCLC患者为2.312±0.28，与健康对照组(1.000)相比差异显著(P<0.01)。

2.3外周血浆中IL-17含量的测定 NSCLC患者血浆中IL-17的含量为(2.14±0.23) μg/L,而健康对照组为(1.13±0.22) μg/L， 两组比较差异显著(P<0.001)。因此，NSCLC患者外周血血浆中Th17细胞分泌的IL-17明显高于健康对照组。

2.4不同病理分型及TNM分期NSCLC患者之间的比较 鳞癌患者、腺癌患者外周血中Th17细胞比例、IL-17 mRNA表达水平及外周血浆中IL-17的表达水平比较，均无统计学差异(P>0.05)；Ⅲ期患者外周血中Th17细胞比例、IL-17 mRNA表达水平及外周血浆中IL-17的表达水平较Ⅰ～Ⅱ期患者显著增高，见表2。

表2 不同临床病理特征患者Th17及相关因子变化±s)

3 讨 论

人体抗肿瘤机制主要是细胞免疫，同样肺癌的发生、发展与免疫功能状态也密切相关。T淋巴细胞是细胞免疫的效应细胞，在调节免疫应答中起着重要作用，CD4+T细胞作为T细胞的重要成分，参与机体免疫应答的各个阶段，并且在免疫调节中发挥至关重要的作用。Th17 细胞作为CD4+T细胞的新亚群，在先天性免疫和获得性免疫中均发挥重要功能，并通过分泌IL-17A/F等细胞因子参与肿瘤发病的多个重要生理或病理进程。

在多种肿瘤如胃癌〔8〕、结肠癌〔9〕、肝细胞癌〔10〕及食管癌〔11〕中均可检测到Th17 细胞及其特异性转录因子RORγt及主要效应因子IL-17的高表达，提示Th17细胞可能促进了肿瘤的发生发展及转移。Numasaki等[12]研究NSCLC小鼠模型发现IL-17可促进血管内皮细胞的迁移及内皮细胞索的形成，并可促进肿瘤细胞或肿瘤内间质细胞分泌多种促血管生成的细胞因子,如VEGF、TGF-β、PGE2、MIP-2、趋化因子等,从而促进肿瘤新生血管的发生，利于肿瘤生长、转移和浸润。

本文结果表明NSCLC细胞存在Th17细胞高表达现象。NSCLC患者IL-17及RORγt mRNA的表达水平显著高于健康对照组，表明CD4+T细胞向Th17细胞分化增多。NSCLC患者外周血中IL-17含量增多，表明NSCLC患者Th17细胞分泌细胞因子IL-17增多，并可能通过其参与NSCLC的发生。这些均说明NSCLC患者体内Th17及其相关因子高表达，抑制Th17的高表达有可能成为治疗NSCLC的新靶点。

目前尚无直接证据证明IL-17与NSCLC的病理类型和临床分期相关。但研究〔13〕发现，Th17 细胞与NSCLC的病理分期存在着一定的关系，随后进一步分析IL-17 mRNA及外周血浆中IL-17在两组间的表达水平差异，结果显示，IL-17 mRNA的表达水平及IL-17的含量在Ⅲ期患者显著增高。在细胞、基因、蛋白3个水平均反映了IL-17的表达随着NSCLC的进展而表达上调，提示Th17 细胞参与了NSCLC的增殖、浸润和远处转移。

综上所述，本研究结果表明Th17细胞及其相关因子可能参与了NSCLC的发生、发展以及浸润、转移，我们可以尝试通过对Th17细胞的干预调控，为临床治疗提供理论依据和新的途径，从而有助于为肿瘤的免疫治疗寻找新策略。

4 参考文献

1Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,etal. Interleukin17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages〔J〕. Nat Immunol,2005；6(11):1123-32.

2Eberl G,Marmon S,Sunshine MJ,etal. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells〔J〕. Nat Immunol,2004；5(1):64-73.

3Egawa T,Eberl G,Taniuchi I,etal. Genetic evidence supporting selection of the Valpha14i NKT cell lineage from double-positive thymocyte precursors 〔J〕. Immunity,2005；22(6):705-16.

4Teng MW,Andrews DM,McLaughlin N,etal. IL-23 suppresses innate immune response independently of IL-17A during carcinogenesis and metastasis〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,2010；107(18):8328-33.

5Yang K,Vega JL,Hadzipasic M,etal. Deficiency of thrombospondin-1 reduces Th17 differentiation and attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis 〔J〕. J Autoimmun,2009；32(2):94-103.

6Ziegler SF,Buckner JH. FOXP3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation 〔J〕. Microbes Infect,2009;11(5):594-8.

7Jyoti Das,Ren G,Zhang LY,etal. Transforming growth factor β is dispensable for the molecular orchestration of Th17 cell differentiation 〔J〕. J Exp Med,2009；206(11):2407-16.

8Zhang B,Rong G,Wei H,etal.The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer 〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun,2008；374 (3):533-7.

9Legouvello S,Bastujl-Garn S,Aloulou N,etal. High prevalence of Foxp3 and IL-17 in MMR-proficient colorectal carcinomas 〔J〕.Gut,2008；57 (6):772-9.

10Zhang J P,Yan J,Xu J,etal. Increased intra tumoral IL-17 producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients 〔J〕. J Hepatol,2009；50 (5):980-9.

11亓 磊,田 辉,岳韦名,等. 食管鳞癌患者外周血中Th17 细胞的检测及其临床意义〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2011;18(1):59-62.

12Numasaki M，Watanab M，Suzuki T，etal. IL-17 enhances the net angiogenic activity and in vivo growth of human non-small cell lung cancer in SCID mice through promoting CXCR-2-dependent angiogenesis 〔J〕. J Immunol,2005;175(9):6177-89.

13黄菁菁,叶娉婷,孙 力,等.宫颈癌患者外周血Thl 7细胞水平变化及意义〔J〕.山东医药,2012;52(11):65-7.