ABCG2、MDR1基因表达水平与5-氟尿嘧啶耐药的CD44+SGC-7901/5-Fu多药耐药关系

李跃军 卓德斌

(湖南中医药高等专科学校第一附属医院肿瘤科，湖南 株洲 412000)

胃癌是我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是临床治疗胃癌常用的化疗药物，但有效率低，容易产生耐药性，如何克服其耐药是目前胃癌治疗的难点。肿瘤细胞高表达ABC转运蛋白家族(乳腺癌耐药蛋白ABCG2、P-糖蛋白MDR1)使肿瘤具有原发性多药耐药性，使肿瘤细胞能逃离多种化疗药物的毒性和杀伤作用。本实验通过体外观察5-Fu耐药的CD44+ SGC-7901/5-Fu细胞株ABCG2、MDR1基因表达水平，初步探讨其获得性耐药机制。

1 材料和方法

1.1细胞株及主要试剂 胃癌细胞株(SGC-7901)购自中科院上海生物研究；5-Fu(Sigma，美国)；鼠抗人CD44抗体(Biolegend，美国)；MTT(Sigma，美国)；胰蛋白酶 (Amreseo，美国)；新生牛血清(Sigma，美国)。RPMI-1640 (Gibco，美国)。AnnexinⅤ-FITC 凋亡检测试剂盒(北京宝赛公司)。

1.2实验设备 生物安全柜(THERMO，美国)；CO2培养箱(德国)；倒置显微镜 (OLYMPUS，日本)；酶标仪(Biorad，美国)；FACSAria流式细胞仪(Biolegend，美国)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 用含10%灭活小牛血清(FBS)和青、链霉素(100 U/ml)的RPMI-1640培养液体外培养SGC-7901。37℃、5%CO2，根据细胞生长情况，每1～2 d换液。

1.3.25-Fu耐药的SGC-7901/5-Fu胃癌细胞模型建立 采用反复大剂量冲击结合逐步递增药物浓度法，取对数生长期的SGC7901细胞，加入5 mg/L 5-Fu，于37e、5% CO2、全湿度培养箱内孵育24 h，用不含Ca2+、P3-的磷酸盐缓冲液 D-Hanks洗1次，将细胞培养于无药RPMI-1640完全培养液中，待细胞恢复生长后(7～10 d)，反复用5-Fu冲击处理，同时逐渐增加药物浓度(5、10、15、20、25、35、40)，经过8次冲击至5-Fu药物浓度达40 mg/L，建立其耐药细胞株 SGC7901/5-Fu。待细胞恢复生长后将其维持培养于含5-Fu 10 mg/L的RPMI-1640完全培养液中，每 2～3 d传代1次。撤药2 w后进行细胞实验。

1.3.3流式细胞仪检测分选CD44+SGC-7901/5-Fu细胞 取对数生长期SGC-7901/5-Fu细胞，胰酶消化后用10%FBS DMEM/F12终止消化，2 500 r/min离心5 min后弃上清。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，重悬于含2%BSA的4℃预冷PBS中，调整细胞密度为1×109/L。取300 μl SGC-7901/5-Fu细胞，每100 μl细胞悬液加入CD44-FITC均匀混合，4℃避光孵育30 min后，PBS洗涤2次，2 500 r/min离心5 min后弃上清，将细胞沉淀悬浮于500 μl PBS中。使用FACSAria流式细胞仪进行检测和分选。

1.3.4MTT比色法测定耐药指数及交叉耐药性 分别收集对数生长期的SGC-7901、SGC-7901/5-Fu、CD44+SGC-7901/5-Fu 、CD44-SGC-7901/5-Fu细胞，调整细胞浓度至2×108cells/L。取各组细胞悬液接种于96孔板内，100 μl/孔孵育24 h后再加入8个倍比浓度梯度稀释的5-Fu、ADM、MMC和DDP，调整每孔终体积至200 μl。以不加化疗药物的组作为对照组；仅加入200 μl RPMI-1640完全培养液为空白组。96孔培养板于细胞培养箱中孵育72 h后，每孔加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)(5 g/L)20 μl，继续孵育4 h后，2 000 r/min离心10 min，弃上清。每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪上以570 nm波长测定各孔吸光度(A)值。细胞生存率(%)=(实验组A平均组/对照组A平均值)×100%；以药物浓度对数为横轴，生存率为纵轴，做出量-效曲线，求得半数抑制率(IC50)，计算耐药指数。耐药指数(RF)=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。

1.3.5RT-PCR检测ABCG2、MDR1 mRNA表达水平 分别取对数生长期SGC-7901、SGC-7901/5-Fu、CD44+SGC-7901/5-Fu 、CD44-SGC-7901/5-Fu细胞，用Trizol提取总RNA，采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成eDNA，取反转录产物2 μl进行PCR反应。引物设计，采用Premier 5.0软件设计，ABCG2、MDR1与β-actin mRNA的扩增产物分别为342 bp、237 bp与500 bp。ABCG2：正义5′-GCGACCTGCCAATTTCAAAT-3′，反义5′-AGCCAGTTGTAGGCTCATCCA-3′。MDR1：正义5′-CGCCAATGATGCTGCTCAAG-3′，反义5′-ACCAAGTAGGCTCCAAACCC-3′。β-actin正义5′-CAGGGTGTGATGGTGGG-3′，反义5′-GGAAGAGGATGCGGCAG-3′。PCR反应体系(25 μl)：模板cDNA1 μl，正、反义引物各0.5 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl、dNTPs(2 mmol/L)2.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)3 μl、10×PCR Buffer 2.5 μl，ddH2O 14.7 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃复性30 s，72℃延伸60 s。40个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，Quantity One 图像分析处理系统进行灰度扫描。ABCG2、MDR1 mRNA表达水平以各目的基因片段OD值/内参照β-actin密度值表示。

1.4统计学处理 采用 SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组细胞耐药指数及交叉耐药性比较 MTT法检测CD44+SGC-7901/5-Fu相对于SGC-7901细胞的RF为12.5(P<0.05)，但CD44-SGC-7901/5-Fu相对于SGC-7901细胞的RF为1.2(P>0.05)。CD44+SGC-7901/5-Fu对ADM、MMC和DDP也有交叉耐药性，CD44-SGC-7901/5-Fu对ADM、MMC和DDP无交叉耐药性。见表1。

2.2各组细胞ABCG2、MDR1 mRNA表达水平 见表2。与对照组(正常SGC-790)细胞比较，ABCG2、MDR1在5-Fu耐药的SGC-7901细胞株中表达明显增强(P<0.05)。与5-Fu耐药的SGC-7901细胞株比较，CD44+SGC-7901/5-Fu细胞株ABCG2、MDR1表达继续增加(P<0.05)。与5-Fu耐药的SGC-7901细胞株比较，CD44-SGC-7901/5-Fu细胞ABCG2、MDR1表达差别无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组细胞±s,mg/L)及交叉耐药性

表2 各组ABCG2、MDR1 mRNA表达水平±s)

3 讨 论

各研究表明，肿瘤耐药细胞系中肿瘤干细胞比例增加是肿瘤耐药的主要原因，其机制与肿瘤干细胞高表达ABCG2和MDR1密切相关〔1～5〕。近年的许多研究结果认为CD44+胃癌细胞具有自我更新和分化能力，该亚群细胞是胃癌肿瘤干细胞，并且可能是肿瘤耐药的主要原因〔6，7〕。 本研究表明，CD44+细胞较正常SGC7901细胞和CD44-细胞耐药指数明显增加，并呈现明显多药耐药性，是SGC7901细胞中主要的耐药细胞亚群。

ABCG2 能主动转运多种化疗药物，将药物从细胞内转运至细胞外。表达特征与恶性肿瘤化疗效果有密切关系，高表达者化疗效果不佳；低表达疗效较好。研究发现ABCG2主要通过结合和水解并利用能量将细胞内的药物泵出，降低胞内药物浓度和减轻细胞毒作用，从而可使机体对抗肿瘤药物产生耐药〔8，9〕。

MDR1基因编码的P-g(P-糖蛋白)是一种三磷酸腺苷(ATP)依赖性转运排出泵，有与ATP结合的位点。当肿瘤细胞与抗肿瘤药物接触，脂溶性药物随浓度梯度进入细胞，P-gp即与药物分子结合并连接ATP位点，形成1个磷酸化和糖基化ATP-结合盒蛋白的药物大分子。当ATP水解，释放的能量将已进入细胞内的药物从胞内泵出胞外，使肿瘤细胞内药物浓度降低。肿瘤细胞耐药程度、胞内药物浓度与胞膜表面的MDR1表达密切相关，抑制MDR1基因表达可逆转细胞的耐药性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性〔8，10〕。

Zhou等〔4〕发现胰腺癌细胞系PANC1中肿瘤干细胞高表达MDR1和ABCG2，推测是PANC1肿瘤干细胞耐药的主要原因。Zheng等〔5〕发现甲状腺癌多柔比星耐药细胞系中肿瘤干细胞比例及MDR1、ABCG2表达明显升高，抑制肿瘤干细胞MDR1、ABCG2可增加其对多柔比星的敏感性。CD44+SGC-7901/5-Fu细胞株ABCG2、MDR1 mRNA表达较正常SGC-7901细胞株及5-Fu耐药的SGC-7901/5-Fu细胞株明显增强，可能是其获得性耐药的原因，值得进一步研究。

4 参考文献

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