谷胱甘肽与阿霉素联用对肺癌A549细胞增殖的影响

陆何林 吴科锋 吕应年 朱建红 李 立

(广东医学院药学院，广东 湛江 524023)

阿霉素已被广泛用于急性白血病、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的治疗〔1〕。但是，由于会产生剂量依赖的心脏毒性，阿霉素临床应用受到限制〔1〕。造成阿霉素这种毒副作用的机制虽然尚无定论，但氧化应激及细胞凋亡是最可能的原因，这是因为阿霉素可诱导心肌细胞产生活性氧(ROS)/活性氮并触发细胞凋亡信号从而导致心肌细胞死亡〔2～6〕。因此，许多研究以抑制阿霉素诱导的活性氧(ROS)/活性氮及细胞凋亡为目的并以此阻止心脏毒性的发生〔7～11〕。但是，目前还没有一个药物被证明能够有效、安全地预防阿霉素的此类毒副作用。还原型谷胱甘肽(GSH)为非酶性抗氧化剂，通过其巯基氧化-还原态的转换，作为可逆的供氢体，在细胞内发挥抗氧化作用。GSH(泰特)目前已被临床用于预防药物毒性，但关于其可否作为阿霉素化学保护剂的探讨还未见报道，本研究就此初步探讨。

1 资料与方法

1.1试剂及仪器 RPMI-1640培养基干粉、MTT(Sigma公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；注射用阿霉素(海正药业)；GSH、活性氧检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)；蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、GAPDH单克隆抗体、ECL化学发光试剂盒、PVDF膜(凯基)；p53单克隆抗体(博士德)；辣根过氧化物酶标记抗鼠抗体(Santa公司)；YJ-875医用净化工作台(苏州净化设备公司)；CO2恒温培养箱(Precision 公司)；ELx800 酶标仪(BIO-TEK 公司)；流式细胞仪(EPICS XL公司)；垂直电泳仪(Bio-rad公司)。

1.2细胞培养 A549为非小细胞肺癌细胞系，由本实验室液氮冷冻保存。A549细胞于含10%新生牛血清的RMPI 1640培养液内，在37℃、含5% CO2的饱和湿度空气中培养。

1.3MTT法检测癌细胞存活率 接种A549细胞于96孔培养板，确定每孔含细胞2 000个。细胞贴壁后换液，并设下列实验组：对照组、GSH 100、300、900 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 100 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 300 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 900 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml。实验组每个剂量设8个平行孔，阴性对照组同样设8孔。经24、48、72 h培养后，加MTT染液(MTT终浓度为0.5 mg/ml)继续培养4 h，弃上清，每孔加DMSO 100 μl，震荡5 min后以酶标仪检测波长570 nm处吸光度，计算肿瘤细胞存活率。

1.4采用血球计数板检测癌细胞存活率 由于高浓度GSH可以使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)造成假阳性，因此当按下列方法处理细胞时采用血球计数板检测癌细胞存活率：阴性对照组、GSH 1 000、3 000、9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、1 000 μg/ml+ 阿霉素1.5 μg/ml、3 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml。经30 h培养后，检测细胞存活情况。

1.5流式细胞仪检测细胞内ROS、细胞凋亡 接种细胞于6孔细胞培养板，细胞贴壁后按下述方法处理：阴性对照、GSH 9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml + 阿霉素1.5 μg/ml。24 h培养后，按试剂盒说明书检测细胞内ROS生成及细胞凋亡水平。

1.6Western印迹检测 接种细胞于6孔细胞培养板，细胞贴壁后按下述方法处理：阴性对照、GSH 9 000 μg/ml、阿霉素1.5 μg/ml、GSH 9 000 μg/ml + 阿霉素1.5 μg/ml。24 h培养后收集细胞，并按照蛋白提取试剂盒所附操作指南提取细胞蛋白，以蛋白定量试剂盒测定所提蛋白浓度，分装后冷冻保存。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h 后加一抗，4℃孵育过夜；洗膜后加二抗，室温孵育1 h；洗膜、曝光显影。

1.7统计学方法 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1100、300、900 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素对A549增殖活性的影响 100、300、900 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素处理24 h、48 h及72 h，对A549增殖活性均无显著性影响(表1)。

表1 各剂量GSH单独或联合阿霉素处理对A549细胞活性的影响±s，%，n=8)

2.21 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素对A549增殖活性的影响 1 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH单独处理30 h细胞活性为(74.5±7.6、76.7±6.7、78.6±6.3)，与对照组(100±5.6)相比，可显著抑制A549的增殖活性(P<0.05)；1 000、3 000、9 000 μg/ml的GSH与阿霉素联用30 h(46.8±2.4、49.22±3.2、46.9±1.9)，并不能显著改变阿霉素(39.2±2.5)对A549细胞的杀灭效果。

2.39 000 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素对A549内ROS生成的影响 阿霉素处理24 h，有ROS生成的A549 细胞比例(9.7±0.9)与对照组(0.8±0.3)相比显著升高，而单用9 000 μg/ml GSH(0.6±0.2)及与阿霉素联用(5.0±0.6)，可显著降低有ROS生成的A549细胞比例。

2.49 000 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素对A549细胞凋亡的影响 与对照组(82.7± 5.8)%相比阿霉素可显著降低活的A549细胞百分比(57.8±7.7)%，即可显著提高坏死、死亡、晚期凋亡及早期凋亡细胞的百分比；9 000 μg/ml GSH(65.8±5.7)%与阿霉素联用(73.5±6.6)%并不能改变阿霉素所造成的活的A549细胞百分比的降低。

2.59 000 μg/ml的GSH单独或联合阿霉素对A549细胞内p53表达的影响 GSH、阿霉素单独或联用对p53蛋白表达均无影响(图1)。

A.对照组；B.GSH 9 000 μg/ml；C.阿霉素1.5 μg/ml；D.GSH 9 000 μg/ml+阿霉素1.5 μg/ml

3 讨 论

一个理想的阿霉素化学保护剂，除了可以减少心脏毒性等毒副作用外，还需不影响阿霉素的抗癌作用。在本研究中，包括极高浓度在内的各浓度的GSH与阿霉素联用，均不影响阿霉素对肺癌细胞的杀灭效果。3个极高浓度的GSH单独处理均可显著抑制肺癌细胞的增殖活性。ROS过度生成被发现在几乎所有癌细胞内，并通过调控与增殖有关的相关基因促进癌细胞的存活〔12，13〕。因此存在这种可能，GSH通过降低癌细胞内ROS水平，间接地抑制了促进癌细胞增殖、存活的基因的表达，从而实现了其抑制癌细胞增殖活性的效果。

本研究提示GSH具有较佳的抗氧化作用。为了进一步探讨GSH与阿霉素联用可能对肺癌细胞的影响，本研究采用流式细胞术分析了极高浓度GSH对A549细胞凋亡的影响。结果表明，GSH与阿霉素联用与阿霉素单独处理相比较，活的肺癌细胞百分率并没有显著差异，从而从另一个角度证明了GSH不影响阿霉素对肺癌细胞的杀灭效果。此外，有研究表明，阿霉素可活化肺癌细胞p53蛋白〔14〕，但是在本研究中，GSH、阿霉素单独或联用对p53蛋白表达均无显著影响。

本研究结果表明阿霉素对肿瘤细胞的细胞毒性几乎与其诱导的ROS生成无关，该毒性应该主要是通过嵌入迅速增殖的肿瘤细胞碱基对并阻止DNA复制而实现的〔8〕。

综上所述，GSH具有较佳的抗氧化作用，GSH即使在极高浓度的情况下也不影响阿霉素对体外肺癌细胞的杀灭效果，提示GSH作为阿霉素化学保护剂的潜在可能性。进一步的研究还需在体内验证上述结果，并检测GSH对外心肌细胞的保护作用。

4 参考文献

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14Kawakami K，Nishida H，Tatewaki N，etal.Persimmon leaf extract inhibits the ATM activity during DNA damage response induced by Doxorubicin in A549 lung adenocarcinoma cells〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem，2011；75(4):650-5.