Heregulin和VEGF在结肠癌组织中的表达及其临床意义

周 青 王冬芽 刘 星

(井冈山大学医学院重点实验室，江西 吉安 343009)

结肠癌是一种高发的恶性肿瘤〔1〕，而恶性肿瘤的发生、发展是一个涉及多基因的分子水平变化的多阶段过程〔2〕。文献认为〔3〕血管内皮生长因子(VEGF) 是病理性血管生成最主要的刺激因子，其在多种恶性肿瘤的生长及转移中发挥着重要作用。研究还表明〔4～6〕，许多肿瘤中VEGF受上游因子调节而过表达，进而诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤生长浸润。Neurcgulins(简称NRG)是一个和表皮生长因子(EGF)相关的生长和分化因子家族〔7〕。近来研究显示〔8～12〕，Heregulin在多种癌症中与EGF受体家族成员HERs结合，再激活一系列的下游信号分子促进癌细胞增殖浸润。但是，在恶性肿瘤发生发展中Heregulin与VEGF的关系及其意义目前仍少见报道。本研究中，笔者采用Western印迹检测Heregulin、VEGF在结肠癌组织、癌旁组织及远癌正常组织的蛋白表达， 采用RT-PCR检测VEGF在结肠癌组织、癌旁组织及远癌正常组织的基因表达，并探讨二者在结肠癌发生发展中的可能关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取在井冈山大学附属医院就诊的结肠癌根治术患者术后的新鲜肠癌组织标本为研究对象，分组如下：(1)结肠癌组：10例，男5例，女5例，年龄33～81岁，中位年龄61岁。同时收集患者的临床资料，包括肿瘤发生部位、组织学分型、分化程度、Dukes分期、有无淋巴结转移等。(2)癌旁组织组：10例，取上述结肠癌组患者毗邻肿瘤旁的肠黏膜组织。(3)远癌正常组织组：10例，取上述结肠癌组患者肿瘤旁10 cm以外的肠组织。癌旁组织组及远癌正常组织组均经苏木素-伊红(HE)染色病理证实无肿瘤浸润。

1.2Western印迹 取样品与5倍上样缓冲液混合煮沸5 min 后上样进行SDS- PAGE电泳；电泳后以稳定18 V电压， 半干法电转移至PVDF 膜， 用含5%脱脂奶粉TBS/T 缓冲液封闭1 h，加入一抗， 4℃过夜， 洗膜， 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h， 暗室中ECL发光液覆盖膜5 min， X 光胶片曝光，显影，定影，PVDF膜上特异性条带经Olympus BX41凝胶成像仪扫描进行相对定量。所用试剂购自美国Sigma公司及武汉博士德公司。

1.3RT-PCR 按EZ Spin Column RNA Purification Kit说明提取总RNA。核酸蛋白分析仪鉴定RNA样品的浓度和纯度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9～2.0。以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA。反应结束后取出cDNA按1∶1稀释，4℃保存。用于RT-PCR的引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中VEGF的引物序列为：正义：CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG，反义：TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC。β-actin的引物序列为：正义:ACCACCATGTACCCAGGCAT，反义：CCGGACTCATCGTACTCCTG。经由40个循环的变性、退火和延伸，生成的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析，结果用靶基因/β-actin比值表示。RNA纯化试剂盒、SYBR green 染料、MuLV逆转录酶、RNase、Trizol、dNTP、TaqDNA聚合酶等均购自美国Applied Biosystems 公司。

1.4统计学分析 采用SPSS13.0软件。组间比较采用χ2分析或t检验。

2 结 果

2.1Heregulin、VEGF蛋白在各组的表达 图1可见，Heregulin和VEGF在结肠癌组织组的蛋白表达率高于癌旁组织组及远癌正常组织组(P<0.05)，VEGF mRNA表达及蛋白表达呈显著正相关，前者表达较高的标本，后者表达也高。

1.结肠癌组；2.癌旁组织组；3.远癌正常组织组

2.2VEGF mRNA在各组的表达 VEGF在结肠癌组织组的mRNA表达显著高于癌旁组织及远癌正常组织(P<0.05)，见图2。结肠癌组织中Heregulin与VEGF蛋白表达呈正相关。

1.结肠癌组；2.癌旁组织组；3.远癌正常组织组

3 讨 论

Heregulin分子量为45 kD，为表皮生长因子家族(EGF家族)的分支〔13〕，具有EGF样结构，是Holmes等〔7〕于1992年在生长人乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养基中首先分离得到。近年来有资料报道〔8〕，Heregulin与HERs受体结合后可特异性激活下游信号分子或信号通路介导参与各种癌症尤其是乳腺癌的浸润和侵袭。有文献报道〔14,15〕，Heregulin诱导的乳腺癌细胞系MCF-7中，基质金属蛋白酶(MMP)-7、MMP-1及MMP-9的mRNA及蛋白表达均上调，且MMPs降解胞外基质，促进肿瘤浸润迁移的活性也显著提高。在肝细胞癌HCC2998和MKN45-1细胞中，Heregulin-β1被发现可诱导细胞表面细胞间接触的缺失及增强MUC1表达，进而促进肿瘤的形成〔16〕。Heregulin在结肠癌中的表达及其作用正引起学界的密切关注，但目前所见研究较少，具体机制尚未明确。Yoshioka等〔17〕报道，在发生肝转移的结肠癌患者，肝细胞衍生的Heregulin可能通过增强integrin αvβ5介导的细胞迁移以及ErbB3/ErbB2信号转导途径，在结肠癌的细胞迁移和肝转移过程中，发挥重大作用。本研究提示结肠癌中Heregulin过表达与肿瘤演进侵袭关系密切。

VEGF是肿瘤研究的一个热点〔18〕。VEGF在肿瘤组织中的表达水平比周围的正常组织要高，并与肿瘤的恶性程度相关〔19〕。大量研究表明〔20,21〕，新生血管、淋巴管的形成，在结肠癌等肿瘤的发生发展及转移过程中起着极其重要的作用，而VEGF通过作用于其特异的VEGFR，参与了肿瘤新生血管、淋巴管的形成过程，与肿瘤的恶性程度及预后密切相关。近年还有学者发现〔22,23〕，VEGF-C表达的下调或VEGF/VEGFR2通路的下调可减慢肿瘤生长，抑制肿瘤转移，并指出结肠癌中卡培他滨的抗瘤效应正是与其下调VEGF表达抑制血管生成作用密切相关。然而，结肠癌中Heregulin是否可通过调节VEGF的表达影响血管新生促进肿瘤浸润侵袭却鲜见报道。Nagashima等〔24〕在对乳腺癌的体外研究中发现，Heregulin-beta1刺激乳腺癌上皮细胞后，可诱导VEGF mRNA及蛋白表达，以VEGF依赖方式刺激血管生长。

综上所述，在人类结肠癌组织中，过表达的Heregulin可能通过某信号通路促进VEGF基因启动区的活性，强化VEGF的基因转录，上调瘤组织中VEGF蛋白表达，以VEGF依赖方式诱导新生血管形成，促进肿瘤浸润转移，具体信号通路及其机制尚待深入研究。

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