姜黄素对肝癌细胞株HepG-2的抑制作用

王丹丹 汲 军 项柏冬

(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

肝癌在肿瘤发病率中位列第三。确诊时常常已到晚期,预后差,严重威胁着人类健康。常用的放化疗手段有一定疗效,但常给机体带来严重的副作用。因此，寻找高效低毒的化疗药物，和毒副作用小的纯中药制剂来辅助治疗肝癌成为国内外学者研究的热点。姜黄素(CUR)是从姜黄中提取的天然药物成分，其药理作用广泛，主要有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、脂质过氧化、抗病毒等〔1〕。它具有毒副作用低、价格低廉等优点。许多动物体内实验证实，CUR可抑制胃癌、皮肤癌、结肠癌等癌症的发生，具有明显的抗肿瘤效果。本文主要研究CUR在体外对人肝癌细胞株(HepG-2)的抑制效果，探讨CUR的抗肿瘤活性，以期为CUR的体内活性及临床应用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1仪器、试剂、药品 Bio-RAD550全自动酶标仪：美国伯乐公司；台式高速低温离心机5810R型：德国Eppendorf公司；二氧化碳培养箱：美国Forma公司；电子天平：北京赛多利斯有限公司；Olympus倒置相差显微镜：日本Olympus公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司。RPMI-1640培养基：Gibco公司；小牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；无水二甲基亚砜(DMSO)：分析纯，美国Sigma公司；胰酶：美国Sigma公司；吉姆萨染液：德国AppliChem公司；姜黄素(含量>80%)：美国Sigma公司。细胞株：HepG-2购买于上海生物制品研究所，液氮中冻存保种。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HepG-2接种于含双抗的RPMI-1640培养基并加入FBS培养，置于5%CO2饱和湿度、37.5℃的恒温培养箱中培养24 h后即进入对数生长期，接种后72 h后细胞贴壁生长，用0.25%胰酶将贴壁生长的细胞用直接吹打法传代，每1～2 d更换1次培养基，选择对数生长期细胞用于实验。

1.2.2CUR溶液的配制 将CUR粉剂用少量DMSO溶解，配成1 mmol/L储备液，置于冰箱-20℃中储存备用，实验前解冻，用时稀释至所需药物浓度(DMSO终浓度<0.1%)。

1.2.3分组 空白对照组：加入0.1%DMSO的RPMI-1640培养基和细胞；CUR组：共设6个浓度组(5，10，20，30，40，50 μg/ml)，每孔加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培养基、细胞和相应浓度的CUR。

1.2.4MTT法检测药物对细胞株增殖的影响 取消化后的对数生长期的HepG2，分别以浓度为1×104个/ml的细胞密度接种于96孔培养板中，加入量为200 μl/孔，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育培养24 h。待细胞贴壁生长后加入上述分组浓度的CUR溶液，加药量为200 μl/孔，每组设6个平行孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续孵育4 h。小心吸去培养基上清液，每孔再加入DMSO 150 μl振荡混匀10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪选择490 nm波长，空白孔调零，测定各孔吸光度A值，并计算细胞生长抑制率(IR) 。实验重复3次，取平均值，根据细胞IR判定药物对细胞增殖的影响。IR=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.5集落形成试验检测药物对增殖的抑制作用 贴壁细胞采用平板克隆法：按100/ml、1 ml/孔接种细胞于24孔板，待细胞贴壁24 h后，实验组加入不同浓度的姜黄素(5，10，50 μg/ml)，对照组加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培养基，每组设3个复孔，于 CO2培养箱中培养7～10 d，待培养板中出现肉眼可见的集落时，终止培养。弃去上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)小心浸洗2次。加甲醇0.5 ml/孔，固定15 min，弃去固定液，加2～3滴姬姆萨染液染色20～30 min，然后缓慢流水洗去染色液，空气干燥。肉眼观察并计数细胞集落(≥50 个细胞者计为一个集落)。按以下公式计算集落形成抑制率：集落形成抑制率=(1-实验组集落形成率/对照组集落形成率)×100%

1.2.6细胞形态学观察 将加药后的HepG2，培养48 h后，在倒置显微镜下放大200倍观察细胞变化并拍照。

2 结 果

2.1细胞形态学观察 镜下观察显示，对照组细胞形态伸展,轮廓清晰,成对数生长，加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR的实验组，各浓度CUR组喜宝生长受到抑制，细胞体积缩小呈圆形，与周围的细胞脱离。见图1。

2.2MTT法测定CUR对HepG-2的增殖抑制率 与空白对照组比较，各个浓度的CUR实验组对HepG2均有明显的抑制作用(P<0.05)，并且，随着CUR浓度的增大,对癌细胞的抑制作用越明显，表明CUR可以明显抑制HepG2的增殖，达到控制癌细胞扩散的作用。见表1。

A为空白对照组；B～G分别为加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR实验组

2.3CUR抑制肿瘤细胞集落形成 不同浓度的CUR(5，10，50 μg/ml)的抑制率分别为0.550±0.183，0.201±0.086，0.058±0.011。试验结果显示，随着药物浓度的升高，给药组的集落生长速度较对照组慢，肿瘤细胞所形成的集落数目也逐渐减少，集落形成抑制率逐渐增加。见图2。

表1 CUR对HepG2细胞的抑制作用±s)

图2 CUR作用的肝癌细胞HepG-2集落形成图

3 讨 论

姜黄是郁金属姜科植物姜黄干燥根茎的主要成分,始载于《新修本草》,具行气滞、散风活血而止痛之功效,常用于利胆、消炎、抗菌等治疗。CUR是姜黄的主要成分,也是咖喱、芥末中的主要黄色色素,属于天然植物多酚类抗氧化剂,由于其无毒，在亚洲许多国家被广泛用于调料及食用色素。CUR抗肿瘤的作用由印度学者Kuttan等〔2〕在1985年首次提出，发现CUR可明显抑制中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和Dultoncs淋巴瘤细胞的生长，体内实验也初步证实CUR对小鼠艾氏腹水瘤生长具有抑制作用。随后CUR的抗肿瘤作用日益引起人们的重视，美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药。

本实验结果表明CUR对HepG2细胞有较强的增殖抑制作用。为CUR用于体内的抗肿瘤活性研究提供了科学依据。

4 参考文献

1Kunnumakkara AB,Anand P,Aggarwal BB.Curcumin inhibits proliferation,invasion,angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins〔J〕.Cancer Lett,2008;269(2):199-225.

2Kuttan R,Bhanumathy P,Nirmala K,etal.Potential anticancer activity of turmeric(Curcuma longa)〔J〕.Cancer Lett,1985;29(2):197-202.