葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠的作用及机制

潘亮亮 白光振 强晓菲 张政伟 赵正源

(武警后勤学院附属医院胸外科，天津 300162)

葛根素药理作用广泛，具有调节血管收缩与舒张、降血糖、提高免疫力及抗肿瘤等功能〔1～3〕。前期研究表明，葛根素能抑制人小细胞肺癌H446细胞的生长和增殖，抑制作用呈浓度依赖性〔4〕，但仅局限于体外研究。本研究探讨葛根素对荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)-2水平与基质金属蛋白酶(MMP-2)、-9蛋白表达的影响，初步揭示其体内抗Lewis肺癌作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1试药 葛根素，中国药品生物制品检定所(批号：201011)；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：1204172)；TNF-α、IL-2检测试剂盒，南京建成生物技术有限公司；MMP-2、MMP-9多克隆抗体，美国Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2实验动物与瘤株 SPF级昆明种小鼠50只，8周龄，体重18～22 g，由天津大学实验动物中心提供，适应性饲养1 w后进行实验。Lewis 肺癌购买于北京协和医科大学细胞库。

1.3仪器 酶标仪，美国Bio-Tek公司；蛋白印迹电泳系统，美国Bio-Rad公司；倒置相差显微镜，日本Olympus公司；低温超高速离心机，德国Eppendorf公司；超低温冰箱，日本Sanyo公司。

1.4方法

1.4.1模型制备及分组 脱颈椎处死接种Lewis肺癌细胞14 d的荷瘤小鼠，冰浴无菌条件下剥离肿瘤组织，按1∶3 比例制成细胞悬液，筛网滤过，调细胞数为l×107个/ml。50只小鼠，雌雄各半，随机分为模型组、环磷酰胺(20 mg/kg)组、葛根素低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组。肿瘤匀浆液常规方法接种在小鼠右前肢腋窝下，每只接种0.2 ml，于接种后第2天给药，隔日给药1次，连续给药21 d。

1.4.2抑瘤作用评价 末次给药24 h后，眼球取血，分离血清，按照试剂盒操作指南测定各组TNF-α和IL-2含量。取右腋皮下肿瘤组织，计算抑瘤率。完整取出双肺，苦味酸固定后，镜下计算双肺表面的转移灶数。

1.4.3免疫印迹法检测MMP-2，-9蛋白的表达 取各组Lewis肺癌原发瘤组织100 mg，剪碎、研磨，用组织蛋白提取液溶解，并经超声破碎后，离心(4℃，12 000 r/min，15 min)，取上清。经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)转膜、抗体标记、显影后，以条带大小和深浅初步判断MMP-2、-9蛋白的表达水平，并用Biotech凝胶图像分析系统测定各条带灰度值，将各组产物灰度值与3-羟-3-甲基戍二酰脱氢酶(GAPDH)灰度值比值作为各组产物的相对值。

1.5统计学方法 采用SPSS 13.0软件，样本均数比较采用方差分析ANOVA。

2 结 果

2.1葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤质量及肺转移的影响 给予葛根素21 d后，各剂量组瘤质量均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01)；葛根素低、中、高剂量给药组抑瘤率分别为7.48%、19.0%和35.7%；葛根素各剂量组肺转移灶小而少，同模型组相比，差异具有显著性(P<0.01)。见表1。

表1 葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤质量及肺转移的影响±s)

2.2葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 葛根素低、中、高剂量组荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数与模型组比较均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响±s)

2.3葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠血清TNF-α与IL-2含量的影响 葛根素各剂量组荷瘤小鼠血清TNF-α与IL-2含量呈剂量依赖性升高，葛根素中、高剂量组荷瘤小鼠血清TNF-α含量与模型组比较具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，低剂量组无统计学意义(P>0.05)。葛根素低、中、高剂量组小鼠血清IL-2含量与模型组比较均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α含量的影响±s,pg/ml)

2.4葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤组织MMP-2，9蛋白表达的影响 与模型组比较，随着葛根素给药剂量的增加，Lewis肺癌肿瘤组织MMP-2，9的表达量逐渐减少，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤组织MMP-2与MMP-9蛋白表达的影响±s)

4 讨 论

癌症是全球范围内仅次于心脑血管疾病，死亡率高居第二位的疾病，而目前的治疗手段无论是手术治疗，还是放疗、化疗，其效果都不能让人满意〔5〕。在肿瘤的化学治疗中，最主要的问题是其较大的毒副作用。因此，从传统中药中寻找疗效好、毒副作用少的理想抗癌药物越来越受到人们的重视。本研究结果表明，葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的增长和转移具有显著的抑制作用。肿瘤的发生、增长及转移与免疫功能密切相关〔6,7〕，本研究的结果也初步证实，葛根素抗肿瘤作用与其增强免疫功能有关。MMP是一类被多种细胞分泌的一种肽链内切酶家族，在肿瘤的侵袭、转移中起到了至关重要的作用。目前为止，已经有超过17种的人类 MMP 被测序〔8〕，其中研究最多、最深入的为MMP-2 和 MMP-9。大量的实验及临床研究均证实，MMP-2 和 MMP-9在乳腺癌、直肠癌、结肠癌和肺癌等多种肿瘤的侵袭、转移中扮演着重要的角色〔9～11〕。因此，MMP抑制剂将可以显著降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力。葛根素能够剂量依赖性的抑制MMP-2与MMP-9蛋白表达，此种抑制作用可能是葛根素抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤增长和转移的机制之一。

4 参考文献

1赵莹莲.葛根素的药理作用及临床应用进展〔J〕.安徽医药, 2010；14(12): 1377-9.

2张 雷, 陈立梅, 倪红霞，等.葛根素影响链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4的表达〔J〕.中国临床康复, 2006；10(39): 135-8．

3Yu Z, Li W.Induction of apoptosis by puerarin in colon cancer HT-29 cells 〔J〕.Cancer Lett, 2006；238(1): 53-60.

4李 娟, 胡永华.葛根素对人小细胞肺癌H446细胞周期和相关周期蛋白表达的影响〔J〕.中草药, 2008；39(10): 1535-7.

5谢 峻, 谈 锋.植物来源抗肿瘤药物研究进展〔J〕.中草药, 2007；38(2): 285-9．

6Smith AJ，Humphries SE.Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality 〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev, 2009;20(1): 43-9.

7Kruglov AA, Kuchmiy A, Grivennikov SI,etal.Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: Mouse models 〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev,2008;19(3-4):231-4.

8Giavazzi R, Taraboletti G.Preclinical development of metalloproteinasis inhibitors in cancer therapy 〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol, 2001;37(1): 53-60.

9Park KS,Kim SJ,Kim KH,etal.Clinical characteristics of TIMP2, MMP2, and MMP9 gene polymorphisms in colorectal cancer 〔J〕.J Gastroen Hepatol,2011;26: 391-7.

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11Cavdar Z, Canda AE, Terzi C,etal.Role of gelatinases (matrix metalloproteinases 2 and 9),vascular endothelial growth factor and endostatin on clinicopathological behaviour of rectal cancer 〔J〕.Colorectal Dis,2011;13(2):154-60.