肿瘤坏死因子-α对单核细胞妊娠相关血浆蛋白A表达的影响及调节机制

李卫萍 李虹伟 顾复生

(首都医科大学附属北京友谊医院心血管中心，北京 100050)

单核细胞妊娠相关血(PAPP)-A与炎症密切相关，促进动脉粥样硬化不稳定斑块的形成，在急性冠脉综合征(ACS)的早期诊断、危险分层及预后评估方面有重要的临床应用价值〔1，2〕。前期研究提示炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α可在转录水平上呈剂量时间依赖性诱导人外周血单核细胞PAPP-A的基因表达，但具体细胞内信号调控机制尚不明确〔3〕。核转录因子(NF)-κB是一种多功能转录因子家族，广泛存在于人体各种组织和细胞中，能够调控多种细胞因子及炎症因子的基因转录及表达，在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。本研究探讨NF-κB是否参与TNF-α对人外周血单核细胞PAPP-A基因和蛋白表达的调控。

1 材料与方法

1.1主要试剂 重组TNF-α(rhTNF-α)(美国Peprotech公司)；BAY11-7082(美国Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中科院血液病研究所)；核蛋白提取及NF-κB p65检测试剂盒(美国Active Motif公司)；兔抗人PAPP-A抗体(美国Abcam公司)，膜蛋白提取试剂盒、兔抗β-actin抗体、羊抗兔二抗(北京尚柏生物医学技术有限公司)；胎牛血清、RPMI1640培养基、RNA酶抑制剂、dNTPs、Oligo(dT)15、M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)，SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司)；PCR引物(北京赛百盛公司)。

1.2方法

1.2.1外周血单核细胞的分离与培养 采集健康志愿者外周肘静脉血20 ml，肝素400 U抗凝，生理盐水1∶1稀释。用尖头吸管铺于比重1.077淋巴细胞分离液表面，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1。室温下2 500 r/min离心25 min，吸取中层单个核细胞，PBS洗涤两次后，将细胞重悬于RPMI1640。台盼蓝试验示活细胞率>95%。将细胞接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，用37℃预热的无血清RPMI 1640培养基清洗3次，将未贴壁细胞洗脱，经瑞氏染色鉴定贴附细胞为单核细胞，占85%。

1.2.2细胞实验分组 ①按不同作用时间分组：rhTNF-α(100 ng/ml)作用于人单核细胞不同时间(2、8、16和24 h)。②按不同作用浓度分组：rhTNF-α(25、50和100 ng/ml)作用于人单核细胞24 h。③BAY11-7082干预组：BAY11-7082(20 μmol/L)与人单核细胞共同孵育60 min。④TNF-α+ BAY11-7082组：先用BAY11-7082(20 μmol/L)与人单核细胞共同孵育60 min后，再加入rhTNF-α(100 ng/ml)作用24 h。

1.2.3观察指标的检测

1.2.3.1Western印迹法检测PAPP-A 蛋白的表达 收集细胞加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液，Lowry氏法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，将膜放入封闭液4 ℃过夜。洗膜后分别滴加兔抗人PAPP-A抗体和兔抗人β-actin抗体，室温摇床上孵育2 h，取出滤膜用TBST漂洗3次，然后滴加HRP-山羊抗兔IgG，室温振摇孵育1 h，TBST漂洗3次，洗去未结合的二抗，最后进行曝光、显影、定影及凝胶图像分析。

1.2.3.2实时荧光定量PCR 法检测PAPP-A mRNA的表达水平 实验结束时收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA后，测定RNA纯度、浓度。纯度指标OD260/ OD280控制在1.8～2.0，浓度约为500 ng /μl。以总RNA为模板进行逆转录，按试剂盒说明书进行，总反应体系为20 μl。阴性对照不含M-MLV逆转录酶或RNA模板。所得cDNA 在荧光定量实时PCR仪上进行扩增反应。通过GenBank获得PAPP-A及β-actin基因序列，采用Primer5.0软件设计引物。PAPP-A上游引物 5′-GAG GAG TTG GCA GGA GTA GCA-3′，下游引物 5′-GCC CAG GCT GGC TGT GAC CAA T-3′，长度为141 bp。β-actin上游引物 5′-TGA AGA TCA AGA TCA TTG CTC C-3′，下游引物5′-GGG TGT AAC GCA ACT AAG TCA TA-3′，扩增产物长度184 bp。PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃10 min，95℃变性15 s，60℃退火和延伸1 min，共50个循环。每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照，取PCR产物做熔解曲线，证实PCR产物的特异性。使用7300 System SDS Software分析数据，以β-actin为内参，根据所得样本Ct值计算标准的2-ΔΔCt值，表示mRNA的相对表达量。

1.2.3.3NF-κB活性检测 采用Active Motif的专利技术TransAMTM定量检测磷酸化NF-κB p65水平代表NF-κB活性。提取单核细胞的核蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度。待测样品孔中每孔加入20 μl核蛋白提取液，将反应板置于自动旋转振荡仪上，室温下轻轻摇动(100 r/min)，反应1 h后用缓冲液洗涤3次。加酶标一抗反应1 h，洗涤3次，再加酶标二抗反应1 h，洗涤4次。最后加底物显色，终止后在酶标仪上以主波长450 nm，次波长655 nm比色。根据重组蛋白标准曲线和待测样品的反应吸光度值计算NF-κB p65的含量。以上实验均重复6次。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验及方差分析。

2 结 果

2.1TNF-α诱导人单核细胞PAPP-A蛋白和mRNA表达的时间效应 给予rhTNF-α(100 ng/ml)刺激单核细胞后，PAPP-A的蛋白表达在2 h开始升高，8 h达到高峰，随后表达下降，但在24 h仍高于空白对照组(P<0.05)。PAPP-A的mRNA表达在2 h即达到高峰，随刺激时间延长，表达水平下降，在8 h达到平台期，在16 h、24 h表达未出现进一步下降，但仍高于空白对照组 (P<0.05)，见表1及图1。

2.2TNF-α诱导人单核细胞PAPP-A蛋白和mRNA表达的剂量效应 给予不同浓度TNF-α(25、50和100 ng/ml)刺激24 h后，随着TNF-α刺激浓度的增加，人单核细胞PAPP-A的蛋白和mRNA表达逐渐升高，均显著高于空白对照组(P<0.05)，呈剂量依赖性，见表2及图2。

2.3TNF-α对人单核细胞NF-κB活性的影响 在给予rhTNF-α(100 ng/ml)和人外周血单核细胞孵育24 h后，与对照组〔(0.39±0.03)mg/L〕比较，TNF-α组磷酸化NF-κB p65水平显著升高〔(1.06±0.12)mg/L，P<0.05〕，而BAY11-7082组NF-κBp65水平显著下降〔(0.21±0.05)mg/L，P<0.05〕，TNF-α+ BAY11-7082组磷酸化NF-κB p65水平〔(0.41±0.07)mg/L〕较TNF-α组降低(P<0.05)，与空白对照组相比无显著差异。

表1 TNF-α对单核细胞PAPP-A蛋白和mRNA表达影响的时间效应±s,n=6)

作用浓度蛋白mRNA空白对照组0.116 1±0.011.00±0.0225 ng/ml0.318 8±0.053 51)3.035±0.2061)50 ng/ml0.387 3±0.066 91)3.651±0.3221)100 ng/ml0.408 5±0.069 81)4.985±0.4021)

1：空白对照组；2：25 ng/ml组；3：50 ng/ml组；4：100 ng/ml组

2.4NF-κB参与TNF-α对人单核细胞PAPP-A表达的调控 先给予NF-κB抑制剂 BAY11-7082预处理60 min，再加入TNF-α(100 ng/ml)作用24 h后，人单核细胞PAPP-A的蛋白和mRNA表达较TNF-α刺激组显著下降(P<0.05)，与空白对照组表达水平相似，见表3及图3。

表3 不同处理组单核细胞PAPP-A蛋白和mRNA的表达±s,n=6)

1：空白对照组；2：BAY11-7082组；3：TNF-α组；4：TNF-α+BAY11-7082组

3 讨 论

ACS是一种血栓性疾病，由于冠状动脉不稳定粥样硬化斑块破裂和出血，促进冠脉痉挛、血栓形成，导致心肌缺血坏死。研究证明动脉粥样硬化斑块是否稳定与斑块的大小无关，而炎症浸润及细胞外基质降解是导致斑块不稳定的重要触发因素。Bayes-Genis等〔4〕通过尸检首次证实PAPP-A大量分布于易损斑块的纤维帽肩部、脂质核心周围和巨噬细胞。在表面糜烂的纤维斑块，PAPP-A定位于梭形平滑肌细胞和细胞外基质，而在稳定斑块上无表达或极少量表达。同时研究还发现ACS时血浆PAPP-A浓度升高。此后越来越多的研究进一步证实PAPP-A是预测不稳定斑块的标志物。最近Conover等〔5〕报道ApoE基因敲除小鼠在给予PAPP-A转基因表达后，主动脉粥样斑块病灶的面积增加3.5倍，而PAPP-A/ApoE双基因敲除小鼠的主动脉病灶面积较单一ApoE基因敲除小鼠减少70%，提示PAPP-A可加剧动脉粥样硬化进展。Brügger-Andersen等〔6〕通过血栓抽吸装置获取急性ST抬高性心肌梗死患者罪犯血管的动脉粥样血栓斑块，采用免疫组化方法发现PAPP-A在斑块的细胞外基质中表达丰富，而在血栓形成部位无表达。

既往研究结果显示TNF、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-4等致炎症前细胞因子可诱导培养的人冠脉内皮细胞、成纤维细胞及成骨细胞PAPP-A基因的表达，而干扰素γ(INF-γ)可抑制人成纤维细胞表达PAPP-A〔7,8〕。单核细胞是动脉粥样斑块发生发展过程中最重要的炎症细胞，我们的前期研究发现ACS患者外周血单核细胞的mRNA表达显著高于正常对照组和稳定性心绞痛组，且与外周血循环中的血清PAPP-A水平变化相似。本研究结果显示TNF-α与外周血单核细胞共同孵育后，PAPP-A的蛋白和mRNA表达分别在8 h和2 h达到高峰，同时可呈剂量依赖性诱导人外周血单核细胞PAPP-A的蛋白和mRNA表达，进一步证实了PAPP-A与炎症的相关性。

NF-κB是细胞质内的快反应转录因子，能够调节多种炎症和免疫基因的表达。静息状态下，细胞内NF-κB与抑制因子IκB结合，以无活性形式存在于细胞质中。当细胞受到多种因素刺激后，IκB激酶激活，IκB磷酸化被降解，胞质内的NF-κB易位至细胞核，与其靶基因中的NF-κB位点结合，从而启动各种靶基因的转录。近期研究表明TNF-α可诱导人心肌细胞、成纤维细胞、人冠脉平滑肌细胞内NF-κB p65和NF-κB p50亚单位的易位〔9〕，还可通过抑制NF-κB的DNA结合活性阻断NF-κB活化〔10〕。本研究显示TNF-α可显著升高人外周血单核细胞的磷酸化NF-κB p65水平，提示NF-κB活性增加。此外，在给予NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理阻断NF-κB途径后，再予以TNF-α刺激，结果发现单核细胞磷酸化NF-κB p65水平的下降，提示NF-κB活性降低，同时PAPP-A蛋白及基因表达都较TNF-α刺激组显著下降，与对照组相比无显著差异。

本研究结果提示TNF-α可通过增加NF-κB活性，呈剂量依赖性诱导人外周血单核细胞PAPP-A的蛋白和基因表达，进一步明确了ACS患者外周血循环PAPP-A水平及外周血单核细胞PAPP-A表达增加的机制。目前PAPP-A在ACS早期诊断及预后分层方面的临床应用价值已得到越来越多学者的关注，但其在心血管系统特别是动脉粥样硬化发展中的生物学作用还期待更深入的基础实验研究明确。

4 参考文献

1Mei WY, Du ZM, Zhao Q,etal. Pregnancy-associated plasma protein predicts outcomes of percutaneous coronary intervention in patients with non-ST-elevation acute coronary syndrome 〔J〕. Heart Lung, 2011;40(3):e78-e83.

2You L, Li L, Zhang F,etal. A pilot study of the clinical relevance of the relationship between the serum level of pregnancy-associated plasma protein A and the degree of acute coronary syndrome 〔J〕. J Int Res, 2010;38(2):625-32.

3李卫萍，顾复生，贾三庆. C反应蛋白和肿瘤坏死因子-α对单核细胞妊娠相关血浆蛋白-A mRNA表达影响的实验研究 〔J〕. 中华心血管病杂志, 2006;34(12):1117-21.

4Bayes-Genis A, Conover CA, Overgaard MT, et al. Pregnancy-associated plasma protein a as a marker of acute coronary syndromes 〔J〕. N Engl J Med, 2001;345(14): 1022-9.

5Conover CA, Mason MA, Bale LK,etal.Transgenic overexpression of pregnancy-associated plasma protein-A in murine arterial smooth muscle accelerates atherosclerotic lesion development 〔J〕. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010;299(2): H284-91.

6Brügger-Andersen T, Bostad L, Sandnes DA,etal. The activity of pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) as expressed by immunohistochemistry in atherothrombotic plaques obtained by aspiration thrombectomy in patients presenting with a ST-elevation myocardial infarction: a brief communication 〔J〕. Thromb J, 2010;8(1):1.

7Conover CA, Harrington SC, Bale LK. Differential regulation of pregnancy associated plasma protein-A in human coronary artery endothelial cells and smooth muscle cells 〔J〕. Growth Horm IGF Res, 2008;18(3):213-20.

8Conover CA, Chen BK, Resch ZT. Regulation of pregnancy-associated plasma protein-A expression in cultured human osteoblasts 〔J〕. Bone, 2004;34(2):297-302.

9Demyanets S, Kaun C, Pentz R,etal. Components of the interleukin-33/ST2 system are differentially expressed and regulated in human cardiac cells and in cells of the cardiac vasculature 〔J〕. J Mol Cell Cardiol, 2013;60C:16-26.〔Epub ahead of print〕.

10Koo TY, Kim YJ, Yang WS,etal. Mycophenolic acid regulates spleen tyrosine kinase to repress tumour necrosis factor-alpha-induced monocyte chemotatic protein-1 production in cultured human aortic endothelial cells〔J〕. Cell Biol Int, 2013;37(1):19-28.