基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗对CD8+T 细胞的免疫抑制效应

石雁冰 郉立志 李树法 张媛媛 张兰举 马桂洁 姜春艳

(贵阳中医学院第一附属医院门诊部，贵州 贵阳 550002)

目前1型糖尿病(T1DM)以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，其费用高昂且副作用大，亟需寻找一种特异性免疫干预策略〔1～4〕。研究表明，诱导自身反应性CD8+T细胞的免疫耐受是一种有效的T1DM治疗策略，可减缓甚至完全阻断T1DM的发生和发展〔5,6〕。B、T淋巴细胞弱化因子(BTLA)为近年发现的负性共刺激分子，抑制或下调T细胞的活化和细胞因子的产生，参与多种免疫性疾病的发生、发展〔7,8〕。ZnT8又称SLC30A8，介导锌离子从胞浆至囊泡的转运，参与胰岛素的合成、储存和分泌的调节。ZnT8也可作为自身抗原引起T细胞介导的以β细胞受损为特征的自身免疫反应，甚至诱发T1DM〔9〕。在本实验中，制备基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并观察对CD8+T 细胞的抑制效应。

1 材料与方法

1.1融合肽 为RKKRRQRRRLLIDLTSFL，委托中科亚光合成。其中N末段RKKRRQRRR为含有正电荷的阳离子穿膜肽HIV-Tat49-57 , C末段LLIDLTSFL为ZnT8的人白细胞抗原(HLA2)-A2.1限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。BTLA表达质粒和对照空白质粒由本实验室构建。CD8+T细胞分离试剂盒购自Miltenyi 公司。ELISPOT检测干扰素(IFN-γ)试剂盒购于法国DIACLONE公司。其他为常用试剂。

1.2疫苗的制备 在特定的NaCl浓度下将100 μg/ml的100 μl阳离子肽溶液逐滴滴入100 μl混旋状态含有500 μg/ml DNA的水溶液中，5 μl/min，从而制备疫苗。滴定完毕后制备产物继续混旋30 min，静置30 min。

1.3体外免疫 HLA2-A2.1 阳性的健康人外周血浓缩白细胞经常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基调节细胞为1×106/ml。分别用肽终浓度为10 μmol/L 的含有表达质粒BTLA的疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽， 空白质粒疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，磷酸盐缓冲液(PBS)+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，反复刺激PBMC，每7 d 刺激1 次，刺激3次后第3天，收集PBMC，作为效应细胞进行ELISPOT检测和标准51 Cr释放实验。

1.4免疫磁珠分选( MACS) 纯化CD8+T细胞 取4×107细胞，1 200 r/min 离心10 min，去上清液后用160 μl 缓冲液重悬，加40 μl 抗体Cocktail 充分混匀，4℃孵育10 min。加160 μl缓冲液，1 200 r /min离心10 min，去上清液，再加入320 μl 缓冲液、80 μl磁性微珠，充分混匀，4℃孵育15 min。用适量缓冲液冲洗，1 200 r/min离心10 min。吸除上清液，用500 μl 缓冲液重悬细胞， 200目筛网过滤成无气泡的单细胞悬液。将MS细胞分离柱置于MACS 磁力架上，先用500 μl 缓冲液洗柱，再将细胞悬液通过MS 柱，1 500 μl 缓冲液洗涤，收集流出液体，离心收集细胞，计数。

1.5ELISPOT检测 参照ELISPOT(IFN-γ)试剂盒使用说明书进行检测。调整细胞为1×106个/ml，于96孔培养板中每孔加入100 μl细胞悬液，各设3个复孔，孵育时间为48 h。阴性对照不加细胞孵育，计数各孔出现的色斑数目。

1.6淋巴细胞增殖能力检测 调整细胞为1×106个/ml，于96孔培养板中每孔加入100 μl细胞悬液，加入终浓度为100 μg/ml的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)，培养72 h。每孔再加入0.1 ml浓度为1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 溶液，继续培养12 h，用PBS漂洗细胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃预冷的体积分数为5% 的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml浓度为0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反应30 min，冷却至室温，转移入闪烁瓶中，加入5 ml 闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数(cpm)，测定DPM值(反映细胞DNA 合成速率)，重复测定3 次。

1.7靶细胞的制备与标记 10 mg/L的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)与1×106个/ml的T2细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养6 h后作为靶细胞。采用标准的51Cr释放实验,于V型板各孔中加入标记的靶细胞1×104/孔。各靶细胞孔中加入不同稀释度的效应细胞, 使相应的效靶比分别为25∶1、50∶1和100∶1，每组设立3个复孔。最大杀伤采用2 mol/L的HCl，自释放为靶细胞加培养基。于37℃、50 ml/L CO2孵育4 h，以1 000 r/min 离心10 min，各取上清液100 μl，用γ计数器分别测定液体闪烁计数值(cpm值)，计算51Cr特异释放率。51Cr特异释放率=(实验组cpm平均值-自释放cpm平均值)/(最大释放cpm平均值-自释放cpm平均值)×100%

1.8统计学处理 采用SPSS10.0软件和t检验对数据差异进行分析。

2 结 果

2.1ELISPOT检测结果 用ELISPOT检测CD8+T细胞的IFN-γ分泌情况。BTLA组CD8+T细胞的IFN-γ分泌数量为(46±7)个，而空白质粒组和PBS对照组的IFN-γ分泌数量为(97±16)个和(104±19)个。实验证明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T细胞的活化。

2.2淋巴细胞增殖结果 用3H-TdR检测CD8+T细胞的增殖情况。BTLA组CD8+T细胞的cpm值为(37 000±3 100)，而空白质粒组和PBS对照组的cpm值为(51 000±6 100)和(53 000±6 400)。实验证明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T细胞的增殖。

2.3Cr释放分析 进一步采用51 Cr释放分析各组诱导的CD8+T细胞反应对靶细胞的杀伤情况。BTLA组诱导CD8+T细胞的杀伤率均明显低于空白质粒组和PBS对照组。实验证明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T细胞的对靶细胞的杀伤。见图1。

图1 各实验组对靶细胞的杀伤率

3 讨 论

目前普遍认为T1DM是在遗传和环境因素共同作用下，由T淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病〔10,11〕。主要是由于免疫系统的异常，CD4+和CD8+T淋巴细胞对胰岛的浸润，引发胰岛炎症并导致对胰岛β细胞的损伤，使胰岛素分泌绝对减少，引起体内胰岛素绝对缺乏从而导致血糖持续升高，产生T1DM〔12,13〕。多种免疫机制参与T1DM的发病，为糖尿病的预防提供了途径和方向。目前研究表明，应用免疫调节药物和细胞等手段可以抑制胰岛炎症作用，减少β细胞的免疫破坏及凋亡，诱导特异性免疫耐受，从而达到预防及阻止糖尿病发病。

BTLA是2003年发现的CD28家族共抑制受体, 主要表达于T、B细胞, 在DC、单核及自然杀伤(NK)细胞上也有表达, 其结构和功能与CD28家族其他两种抑制性受体CTLA-4和PD-1相似〔14〕。现已证明BTLA的配体是HVEM, 两者结合可负性调节T、B细胞的激活与增殖, 维持树突细胞在内环境中的稳定, 抑制记忆性CD8+T细胞的分化, 调节机体固有免疫系统早期抗感染的过程等作用〔15〕。ZnT8 是专一性的锌转运体家族-ZnT 家族的成员之一。ZnT8 是自身免疫性T1DM的主要自身抗原之一，其敏感性及特异性与IA2A、GADA、IAA 这三个被认为是“金标准”的抗原相似〔16〕。ZnT8 在胰岛功能调节中的作用使其有望成为糖尿病治疗的新靶点。

因此，理论上基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗有可能抑制抗原特异性的CD8+T淋巴细胞免疫应答。在本实验中，制备了基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并观察其对CD8+T细胞的免疫抑制效应。实验在体外免疫人外周血单个核细胞，检测对CD8+T细胞增殖和活化情况。实验结果提示该疫苗能有效抑制人外周血单个核细胞的CD8+T细胞增殖，细胞因子分泌和对靶细胞的杀伤能力。

综上所述，基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗对CD8+T细胞具有免疫抑制效应，为T1DM的治疗提供了理论基础。

4 参考文献

1Tisch R, McDevitt H.Insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.Cell,1996;85(3):291-7.

2Castano L, Eisenbarth GS.Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat〔J〕.Annu Rev Immunol,1990;8(12):647-79.

3Churchill JN, Ruppe RL, Smaldone A.Use of continuous insulin infusion pumps in young children with type 1 diabetes: a systematic review〔J〕.J Pediatr Health Care,2009;23(3):173-9.

4Moghissi ES.Insulin strategies for managing inpatient and outpatient hyperglycemia and diabetes〔J〕.M Sinai J Med,2008;75(6):558-66.

5Walter U, Santamaria P.CD8+T cells in autoimmunity〔J〕.Curr Opin Immunol,2005;17(6):624-31.

6Hanninen A, Jalkanen S, Salmi M,etal.Macrophages, T cell receptor usage, and endothelial cell activation in the pancreas at the onset of insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.J Clin Invest,1992;90(5):1901-10.

7Vendel AC, Calemine-Fenaux J, Izrael-Tomasevic A,etal.B and T lymphocyte attenuator regulates B cell receptor signaling by targeting Syk and BLNK〔J〕.J Immunol,2009;182(3):1509-17.

8Deppong C, Degnan JM, Murphy TL,etal.B and T lymphocyte attenuator regulates T cell survival in the lung〔J〕.J Immunol,2008;181(5):2973-9.

9Chimienti F, Devergnas S, Pattou F,etal.In vivo expression and functional characterization of the zinc transporter ZnT8 in glucose-induced insulin secretion〔J〕.J Cell Sci,2006;119(Pt 20):4199-206.

10Ludvigsson J.Therapy with GAD in diabetes〔J〕.Diabetes Metab Res Rev,2009;25(4):307-15.

11Bagley J, Paez-Cortez J, Tian C,etal.Gene therapy in type 1 diabetes〔J〕.Crit Rev Immunol,2008;28(4):301-24.

12Mallone R, van Endert P.T cells in the pathogenesis of type 1 diabetes〔J〕.Curr Diab Rep,2008;8(2):101-6.

13James EA, Kwok WW.CD8+suppressor-mediated regulation of human CD4+T cell responses to glutamic acid decarboxylase 65〔J〕.Eur J Immunol,2007;37(1):78-86.

14Carreno BM, Collins M.BTLA: a new inhibitory receptor with a B7-like ligand〔J〕.Trends Immunol,2003;24(10):524-7.

15Leibson PJ.The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors〔J〕.Curr Opin Immunol,2004;16(3):328-36.

16Enee E, Kratzer R, Arnoux JB,etal.ZnT8 is a major CD8+T cell-recognized autoantigen in pediatric Type 1 Diabetes〔J〕.Diabetes,2012;61(7):1779-84.