厄洛替尼抑制核转录因子κB表达及其对胰腺癌细胞侵袭力的影响

王 林 张秀艳 石国刚 于锦萍 陈 红 房 芳

(河北联合大学附属医院分院药剂科，河北 唐山 063000)

胰腺癌术后转移是胰腺癌手术切除治疗的难点。有报道胰腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的阳性率接近50%，并参与了胰腺癌的发生、发展和转移。本文拟观察厄洛替尼对胰腺癌细胞生长、侵袭的影响及核转录因子(NF)-κB的表达变化。

1 材料和方法

1.1材料 人胰腺癌细胞株(PANC-1)购自中国科学院上海细胞生物学研究所。噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma aldrich公司RAD001用二甲基亚砜(DMSO)配制成1 mmol/L贮备液，实验时用RPMI1640培养液稀释至实验所需浓度。

实验分为空白对照组、表皮生长因子(EGF)处理组、厄洛替尼处理组、EGF联合厄洛替尼处理组。EGF、厄洛替尼作用浓度分别为10 ng/ml、4 μmol/L。联合组为EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2方法 MTT比色法检测细胞增殖变化。调节PANC-1细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 ml DMSO，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞抑制率，抑制率=〔(空白对照组OD值-各实验组OD值)/空白对照组OD值〕× 100%。

Transwell体外侵袭实验：分别收集各处理组的PANC-1细胞培养上清液，置于8 μm孔径的Transwell板(购自Nunc公司)，于半透膜上层加入2×105PANC-1细胞系。4 h后于显微镜以不同高倍视野(5个高倍视野)下计数每个高倍视野平均细胞数。

Western印迹检测NF-κB的p65蛋白水平的表达。收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后-80℃保存备用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，完毕后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭，后放入含一抗的Tris盐酸缓冲液(TBST)，4℃过夜，洗膜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，目标蛋白质用二氨基联苯胺(DAB)显色。计算机扫描，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白做参照。

2 结 果

厄洛替尼对人PANC-1细胞的生长具有抑制作用，并且具有剂量依赖性(P<0.05)。EFG促进PANC-1细胞侵袭，厄洛替尼作用于PANC-1胰腺癌细胞上清液条件培养基可显著抑制PANC-1细胞的侵袭(P<0.05)。Western印迹结果显示，厄洛替尼作用48 h后可以显著抑制胰腺癌PANC-1 细胞分泌NF-κB，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 厄洛替尼抑制PANC-1细胞的生长(%)

3 讨 论

尽管手术是惟一有望治愈胰腺癌的方法，但胰腺癌早期很难发现，临床上的诊断病例大多为晚期，仅10%～20%的患者具有手术根治切除的机会〔1〕。侵袭和转移是胰腺癌患者死亡的主要原因。已有学者证实EGF及其受体在这一过程中起重要作用〔2〕。厄洛替尼为人表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要通过与三磷酸腺苷竞争结合至EGFR胞内酪氨酸激酶功能域，抑制受体自磷酸化而阻止下游信号传导，从而抑制细胞周期进程，加速细胞凋亡，抑制血管生成，进而产生抗肿瘤作用〔3〕。本文结果表明，厄洛替尼可以抑制胰腺癌的侵袭和转移。

NF-κB是一种重要的细胞内信号因子，由P50和P65组成的二聚体，调节许多与细胞生长和分化相关的基因表达〔4〕。胰腺癌组织有较高的NF-κB活性和表达，对于胰腺癌的发展起着一定的推波助澜作用。同时，有研究证实使用NF-κB抑制剂可以阻断NF-κB P65的表达及NF-κB的DNA结合活性〔5〕。本研究发现应用厄洛替尼处理后的胰腺癌PANC-1 细胞增殖明显受到抑制，并且能够明显下调NF-κB的活性。因此，厄洛替尼通过抑制EFG介导的NF-κB的活化，发挥其抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭作用。

4 参考文献

1Tang ZY，Wu YL，Gao SL，etal.Effects of the proteasome inhibitor bortezomib on gene expression profiles of pancreatic cancer cells〔J〕.J Surg Res，2008；145(1)：111-23.

2张 浩，刘小芳，刘昱翼，等.EFG介导的NF-κB促进体外胰腺癌细胞的uPA表达与侵袭力〔J〕.中华肿瘤杂志,2007；29(12)：909-12.

3Vaira V,Lee CW,Goel HL,etal. Regulation of survivin expression by IGF-1 /mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19)2678-84.

4Egan LJ,Toruner M.NF-κB signaling pros and cons of the ring NF-κB as a therapeutic approach.〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;1072(1)：114-22.

5程卓鑫,孙 备,王双佳,等.核因子κB在缺氧微环境中对胰腺癌细胞上皮-间质转化调控作用的实验研究〔J〕.中华外科杂志,2012;50(5):446-51.