裸鼠肝癌模型中miR-20a的作用

任建军 孟兴凯 牛剑祥

(内蒙古医科大学附属医院普通外科，内蒙古 呼和浩特 010059)

肝细胞癌的特点是具有丰富的血运，提示肿瘤血管生成在肿瘤的发展中起着至关重要的作用。临床上一般采取手术、放化疗等综合疗法，然而预后仍不理想〔1,2〕。microRNA-20a(miR-20a)是一种多功能的miRNA。研究发现，miR-20a能决定人间充质干细胞(MSCs)成骨分化的命运和调控成骨分化的过程。同时，miR-20a还是一种癌增殖调节子，可抑制多种肿瘤细胞的增殖、分化并促进肿瘤细胞的凋亡。Fan等〔3〕发现miR-20a表达下调可促进癌细胞增殖，并与HCC预后和生存率相关。本实验拟观察miR-20a对人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下种植肿瘤生长情况以及裸鼠体重的影响，miR-20a对肿瘤组织中VEGFA表达的影响，以期明确miR-20a抑制肿瘤生长的机制。

1 材料与方法

1.1材料和试剂 BALB/c裸鼠(SPF级)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；miR-20a片段，阴性片段及红色荧光标记的转染效率检测对照购自Invitrogen公司；肝癌细胞系HepG2购自中国医学科学院基础医学研究所；MEM-EBSS购自Gibco公司、胎牛血清购自Hyclone公司；免疫组化用VEGFA购自Santa Cruz公司；SP免疫组化试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 肝癌细胞系HepG2用含10%胎牛血清的MEM-EBSS培养基，于37℃、5%CO2条件下培养。细胞长至80%融合进行传代。

1.2.2转染步骤及转染效率的检测 细胞转染前以PBS洗2次，每个转染条件的细胞用100 μl预先放置于室温的Nucleofector®电转液重悬(细胞以电转液重悬后，后续所有操作必须在20 min 内完成)；每个样本细胞悬液中加入300 pmol的相应RNA；将上述细胞悬液转入电转杯中(样品必须覆盖电转杯杯底，且杯底部分不可有气泡存在)，盖上电转杯盖；选择电转程序，并将电转杯放入电转仪中，运行电转程序；电转程序结束立即取出电转杯；使用试剂盒提供的移液管吸500 μl预热的培养基入电转杯中，并轻轻将细胞转入12 孔板中，不可反复吹打细胞；细胞放入孵箱中继续培养，6 h 后更换培养基；阳性对照可于转染后8～12 h 用流式细胞仪检测转染效率。

1.2.3裸鼠接种 上述转染细胞计数后以无血清MEM-EBSS培养基重悬，制备成1×108/ml的细胞悬液，30只裸鼠随机分为3组，实验组(HepG2-miR-20a组)、阴性对照组(HepG2-NC组)和空白对照组(HepG2组)，每组10只。皮下接种转染miR-20a agomir的HepG2细胞、转染阴性片段NC的HepG2细胞和不经任何处理的HepG2细胞，并每周2次，用0.2 ml的注射器将0.1 ml制备的细胞悬液注射于BALB/c裸鼠腋窝中部背侧皮下，接种时严格无菌操作。种植肿瘤长至3～4 mm时，即认为荷瘤成功。

1.2.4肿瘤体积计算方法 肿瘤体积计算公式：V=(肿瘤最长径)×(肿瘤最短径)2/2。根据公式计算肿瘤体积并绘制生长曲线。接种35 d后处死裸鼠，取出肿瘤组织测肿瘤重量，并计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率=(1-处理组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%。

1.2.5免疫组化检测VEGFA表达 组织块固定常规石蜡切片脱蜡水化，其余步骤按试剂盒说明进行。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0 软件行t检验或ANOVA检验。

2 结 果

2.1细胞转染效率检测 采用Lonza电转法进行肝癌细胞HepG2的RNA转染，转染效率可高达90%以上。

2.2裸鼠成瘤及生长状况 HepG2-miR-20a组肿瘤生长较其余两组缓慢，第21天开始HepG2-miR-20a组肿瘤体积与其余两组差异明显。第35天时，HepG2-miR-20a组平均瘤质量为(1.16±0.12)g，明显低于HepG2-NC组(2.66±0.45)g及HepG2组(2.77±0.44)g(P<0.01)。HepG2-miR-20a组与HepG2-NC组相比肿瘤生长抑制率为57%，与HepG2组相比肿瘤生长抑制率为58%。见图2。

图1 裸鼠移植瘤生长曲线

2.3裸鼠体重变化 第35天时，HepG2-miR-20a组肿瘤体积显著低于HepG2-NC组和HepG2组(P<0.01)，且HepG2-miR-20a组裸鼠体重亦显著高于HepG2-NC组和HepG2组(P<0.01)。

2.4免疫组化测定肿瘤组织中VEGFA表达 HepG2-miR-20a组VEGFA表达显著低于HepG2-NC组和HepG2组。见图3。

图3 肿瘤组织中VEGFA表达

3 讨 论

肝癌是世界上最常见的肿瘤之一〔4〕，78%的肝癌是由肝炎病毒感染引起的〔5〕。尽管通过手术切除、血管介入治疗和肝移植等，现在一些肝癌早期可以治愈。然而伴有肝硬化的患者中只有30%适宜做这样的治疗〔6〕。

miRNA最早于1993 年由Lee 等〔7〕在线虫体内发现，是一类约22 nt大小的非编码单链RNA分子。每个miRNA可以调控多个靶基因，而每个基因的mRNA又可以受到多个miRNA的调节。越来越多的证据显示了肿瘤中miRNA的差异表达，如慢性淋巴细胞性白血病中的miR-15a 和 miR-16-1、肺癌中的let-7等〔8，9〕。在肝细胞癌(HCC)中，多个miRNA异常表达已被证明参与了肝癌的恶性生物学行为〔10,11〕，更有学者认为其可以作为优于基因的新的诊断和治疗靶点。

miR-20a和miR-106a分别属于miR-17-92家族和它的旁系miR-106a-363家族。目前有研究发现，miR-20a可以抑制E2F2和E2F3的表达〔12〕。miR-20a还具有抗凋亡的作用，过表达可减少前列腺癌细胞的凋亡。然而，miR-20a在肝癌中的作用目前尚未见报道。本研究通过裸鼠肝癌模型发现，HepG2-miR-20a组肿瘤生长较其余两组缓慢，至实验结束时，HepG2-miR-20a组裸鼠体重显著高于阴性对照组和空白对照组，且HepG2-miR-20a组肿瘤体积显著小于其他两组，同时HepG2-miR-20a组VEGFA表达显著低于HepG2-NC组和HepG2组。提示，miR-20a可能是通过抑制VEGFA表达，从而达到抑制肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长作用。

4 参考文献

1Forner A,Llovet JM,Bruix J. Hepatocellular carcinoma〔J〕. Lancet,2012;379:1245-55.

2Rampone B,Schiavone B,Martino A,etal. Current management strategy of hepatocellular carcinoma〔J〕. World J Gastroenterool,2009;15(26): 3210-6.

3Fan MQ,Huang CB,Gu Y,etal. Decrease expression of microRNA-20a promotes cancer cell proliferation and predicts poor survival of hepatocellular carcinoma〔J〕. J Exp Clin Cancer Res,2013;32:21.

4Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal. Global cancer statistics,2002.〔J〕. CA Cancer J Clin,2005;55:74-108.

5Perz JF,Armstrong GL,Farrington LA,etal. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide〔J〕. J Hepatol,2006;45(4):529-38.

6Sangiovanni A,Del NE,Fasani P,etal. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance〔J〕. Gastroenterology,2004;126(4):1005-14.

7Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V. The C. elegans hereochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisence complementarity to lin-14〔J〕. Cell,1993;75(5): 843-54.

8Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,etal. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕. Proc Natl Acad Sci US A,2004;101:2999-3004.

9Johnson S,Grosshans H,Shingara J,etal. RAS is regulated by the let-7 microRNA family〔J〕. Cell,2005;120:635-47.

10Murakami Y,Yasuda T,Saigo K,etal. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and nontumorous tissues〔J〕. Oncogene,2006;25: 2537-45

11Jiang J,Gusev Y,Aderca I,etal. Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection,cirrhosis,and patient survival〔J〕. Clin Cancer Res,2008;14: 419-27.

12Sylvestre Y,De GV,Querido E,etal. An E2F/miR220a autoregulatory feedback loop〔J〕. J Biol Chem,2007;282(4): 2135-43.